研究目的：

采用现代分子生物学技术对2型糖尿病患者肠道菌群进行研究，了解糖尿病人群肠道菌群的组成结构、多样性和相似性等微生物生态学特征；并与健康人群进行比较，分析其肠道菌群结构是否存在差异，探究糖尿病患者肠道菌群改变的分子特征。

研究内容和方法：

1.　分子指纹图谱研究方法的建立　　为了确定一种能较好分析肠道菌群生态学特征的分子指纹图谱方法，对单链构象多态性（Single-Strand　Conformation　Polymorphism，SSCP）、肠杆菌基因间重复共有序列（Enterobacterial　repetitive　intergenic　consensus，ERIC）、变性梯度凝胶电泳（Denatured　gradient　gel　electrophoresis，DGGE）三种指纹图谱技术进行摸索，通过糖尿病患者和健康人群肠道菌群的比较分析，对三种方法进行初步评价，选择并建立适合本课题肠道微生物群落研究的指纹图谱方法。

2.　糖尿病患者肠道菌群结构和多样性的DGGE分子指纹图谱研究　　制定采样标准，收集2型糖尿病患者和健康人粪便标本，对样品初步处理后，提取粪样中菌群总DNA，利用细菌16S　rRNA基因V3区通用引物PCR扩增菌群总DNA，产物用变性梯度凝胶电泳（DGGE）、条带切胶回收和克隆测序等方法分析，获得指纹图谱和DNA序列，了解糖尿病患者和健康人群肠道菌群的组成、多样性和相似性等特征。

3.　糖尿病患者肠道拟类菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属结构和多样性的研究　　利用拟类菌、双歧杆菌、乳酸菌的种属特异性引物进行PCR扩增，同样采用DGGE指纹图技术分析扩增产物，通过对菌群指纹图谱的分析，探究糖尿病患者与健康人群三种细菌属内多样性、相似性和稳定性特征的差异。

4.　糖尿病患者肠道优势菌属的定量研究　　采用实时荧光定量PCR（Real-time　PCR）方法对糖尿病患者和健康人群肠道普通拟类菌、柔嫩梭菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、消化链球菌五种优势菌属进行定量分析，并比较两组人群五种细菌含量的差异。

研究结果：

1.　研究方法的建立　　对三种分子指纹图谱方法的分析比较发现，DGGE图谱技术分辨率高、重复性好，对肠道菌群多样性、相似性等特征能进行较好分析；SSCP分析结果不够理想，图谱中条带较少（2～4条带），很难反映肠道菌群丰富的多样性；ERIC图谱条带密集，不易分辨，而且后续实验中条带回收测序鉴定细菌有一定难度，因而确定DGGE指纹图谱技术作为本课题的研究方法。

2.　糖尿病患者肠道菌群结构和多样性的特征　　通过对糖尿病组和健康组肠道菌群的DGGE分子指纹图谱分析，发现两组人群肠道菌群呈现复杂的图谱特征，而且具有丰富的多样性和较高宿主特异性；比较肠道菌群的图谱条带数和多样性指数，表明两组无显著性差异，提示本实验中肠道菌群的多样性与糖尿病不具明显相关性；对两组组内和组间相似性分析，糖尿病组（或健康组）组内个体之间菌群相似性程度更高，而两组间的相似性明显小于组内相似性（P＜0.05），提示两组菌群总体上分布有所不同；本实验测序的结果也表明了糖尿病组和健康组肠道菌群组成结构上存在差异，糖尿病患者以Bacteroides属细菌为主，而健康人群以Prevotella属细菌为主。

3.　糖尿病患者肠道拟类菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属结构和多样性特征　　通过对DGGE图谱分析，糖尿病组三种菌属多样性与健康组无显著性差异；组内相似性程度和聚类分析结果显示，对于拟类菌属和双歧杆菌属，糖尿病组内个体间平均相似系数显著低于健康组（P＜0.05）。通过成对相似系数累积分布曲线分析，结果也表明糖尿病组在低相似性系数中所占百分比大于健康组，这些结果提示健康组个体之间菌属结构更相似，而糖尿病组个体更趋于不同，糖尿病有可能影响细菌属内结构和稳定性。

4.　糖尿病患者肠道五种菌属的定量结果　　应用Real-time　PCR定量检测肠道五种菌属，本实验结果表明糖尿病组肠道优势菌含量发生了变化。与健康对照组比较，糖尿病组双歧杆菌和消化链球菌呈显著性降低（P＜0.05），而两组普通拟类菌、乳酸菌属、柔嫩梭菌比较无显著性差异。

结论：

本课题对2型糖尿病患者肠道菌群的微生物生态学特征进行了较为详细的分析，为糖尿病与肠道菌群相关性研究提供了实验依据，得出以下结论：

1.　应用16S　rRNA基因通用引物和种属特异性引物扩增肠道菌群总DNA，结合DGGE指纹图谱技术、克隆测序、实时荧光定量PCR等分子生物学方法能够很好的解析肠道菌群生态学特征。这些非依靠培养的方法具有省力省时、精确敏感的优点，是研究肠道微生物生态学有效的手段。

2.　2型糖尿病患者肠道菌群结构和多样性具有宿主特异性，菌群的多样性与糖尿病的疾病状态无明显相关性，糖尿病个体之间菌群相似性降低，肠道优势菌群的组成和结构发生改变。

3.　从肠道菌群组成结构和多样性、相似性、稳定性等生态学特征上分析，2型糖尿病患者肠道菌群和优势菌属与健康对照人群相比存在一定差异。