目的：
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，外界环境及自身生活习惯的改变使其发病率逐年增高，有超过宫颈癌而居女性恶性肿瘤首位的趋势。乳腺癌发生侵袭转移是造成患者死亡的重要原因。然而，恶性肿瘤的侵袭转移是多因素、多步骤的过程，其具体机制尚需进一步阐明。因此，探索乳腺癌的侵袭转移机制是当前基础和临床研究的难点和热点。近年研究表明：肿瘤细胞的异质性与肿瘤发生侵袭转移密切相关，而EMT在该过程中担任重要角色。此外，目前研究普遍认为：肿瘤干细胞是多种肿瘤形成的源泉，其在维持肿瘤生长、血管生成以及促进肿瘤侵袭进展方面发挥关键作用。现已在多种肿瘤中包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胶质瘤等均发现肿瘤干细胞的存在。但是，EMT与肿瘤干细胞的形成是否相关，以及具体机制尚不清楚。Notch信号参与调控细胞的增殖、干细胞的自我更新以及新生组织的分化。新近研究显示：Notch信号通路在肿瘤进展中发挥重要作用，其可以促进EMT的发生。在本研究中，我们主要探讨：
1.　Notch1对乳腺癌发生发展的影响；
2.　Notch1是否通过诱导EMT发生从而促使乳腺癌细胞“干性”获得；
3.　Notch1促进乳腺癌干细胞表型获得的分子机制。
本研究将为阐明乳腺癌的侵袭转移机制提供新线索，并为以肿瘤干细胞为靶点的乳腺癌靶向治疗提供理论依据。
方法：
1.　构建过表达的Notch1基因载体并转染乳腺癌细胞MCF7和MCF10A，利用Real-time　PCR检测转染后的MCF7和MCF10A细胞中Notch1基因的mRNA转录水平，用Westernblot　检测Notch1在MCF7和MCF10A细胞的蛋白表达情况；
2.　通过MTT检测Notch1过表达对乳腺癌细胞MCF7和MCF10A增殖能力和耐药性的影响；利用Transwell实验方法观察Notch1对乳腺癌细胞MCF7和MCF10A迁移和侵袭能力的影响；
3.　利用倒置显微镜观察上调Notch1基因对MCF7和MCF10A细胞的形态学影响；利用Real-time　PCR、Western　blot和免疫荧光等实验方法观察Notch1对于乳腺癌细胞EMT标志物表达的影响；
4.　通过筛选得到稳定过表达Notch1的MCF7和MCF10A细胞，利用微球培养法观察乳腺癌细胞微球形成能力；利用免疫荧光法检测干细胞标记蛋白的ALDH1A1的表达情况；采用流式细胞仪检测CD44+/CD24-/low细胞比例以及Notch1对MCF7和MCF10细胞周期的影响；
5.　将对照组和稳定过表达Notch1的MCF7细胞接种于裸鼠乳腺部位，观察肿瘤生长情况，并绘制生长曲线观察Notch1与肿瘤发生的关系；通过免疫组化方法检测肿瘤组织EMT中标志物的表达情况；
6.　利用Westernblot　检测对照组和过表达Notch1的MCF7和MCF10A细胞中STAT3、p-STAT3、p65和IL-1β的蛋白表达水平，以及阻断STAT3通路后p65、IL-1β、survivin、bcl-2、E-cadherin和N-cadherina的蛋白表达水平，探索Notch1与STAT3通路及炎症相关因子在调控EMT发生和肿瘤细胞“干性”获得方面的相互作用机制。
结果：
1.　Notch1上调前后的Notch1　mRNA水平：MCF7细胞分别为0.85±0.23、1.86±0.31，与对照组相比，MCF7-notch1细胞的Notch1　mRAN表达明显增加　（P＜0.05）；转染前后Notch1在MCF10A细胞的mRNA水平分别为0.69±0.15、1.78±0.32，与对照组相比，MCF10A-notch1细胞的Notch1　mRAN表达增加（P＜0.05）。其中阴性对照组与对照组无统计学差异。Western　blot　检测MCF7-notch1细胞的Notch1蛋白表达高于对照组（P＜0.05），MCF10A-notch1细胞的Notch1蛋白表达高于对照组（P＜0.05）。MTT检测结果显示：Notch1过表达后，乳腺癌细胞的增殖速度明显增加（P＜0.05）；　应用化疗药物喜树碱后，与对照组相比，其对Notch1过表达的MCF7和MCF10A细胞的抑制率明显降低（P＜0.05）。Transwell实验结果表明Notch1上调后细胞迁移和侵袭能力提高（P＜0.05）；
2.　细胞在体外培养过程中，发现Notch1过表达后，MCF7和MCF10A细胞发生了一系列具有EMT特征的形态学和分子生物学改变：细胞形态逐渐变成梭形，细胞间隙增大，有的细胞膜伸出伪足，间质标志物N-cadherin、vimentin和fibronectin表达显著上调，上皮标志物E-cadherin和occludin表达显著下调（P＜0.05）等。免疫荧光检测上皮标志E-cadherin表达降低，间质标志vimentin表达增加；
3.　Notch1过表达对MCF7和MCF10A细胞周期的影响：MCF7-notch1细胞的G0\G1期细胞比例为80.09%，高于对照组61.85%（P＜0.05）。MCF7细胞Notch1转染组G0\G1期细胞比例为73.72%，对照组为57.83%（P＜0.05）。该结果证明Notch1过表达可使细胞出现G1期阻滞；
4.　裸鼠乳腺癌移植瘤模型中，通过生长曲线可以看出，Notch1过表达显著增加了肿瘤的生长速度（P＜0.05）。Notch1过表达的肿瘤组织中E-cadherin　表达水平低于对照组，而N-cadherin和vimentin表达增加；
5.　上调Notch1后，MCF7和MCF10A细胞的Stat3水平无明显变化，但STAT3磷酸化水平明显升高（P＜0.05）；p65、IL-1β、survivin和bcl-2的蛋白表达水平明显增加（P＜0.05）；MCF7-notch1和MCF10A-notch1细胞经过STAT3磷酸化抑制剂处理后，与未处理组相比，p-STAT3、p65、IL-1β、survivin、bcl-2和N-cadherin的蛋白表达水平降低，而E-cadherin表达增高（P＜0.05）。
结论：
1.　Notch1过表达能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，增强了乳腺癌细胞的耐药性；
2.　Notch1过表达能够促进乳腺癌细胞的EMT发生；
3.　Notch1过表达诱导乳腺癌细胞发生G1期阻滞；
4.　Notch1促使乳腺癌细胞“干性”的获得；
5.　阻断STAT3通路可抑制Notch1诱导的EMT过程；
6.　Notch1过表达通过促进STAT3磷酸化从而增加了乳腺癌细胞中炎症相关因子的表达水平。