摘　　要
目的：
应用分子生物学技术，采用DNA扩增后直接测序、克隆测序分析技术，并结合血型血清学方法，研究中国人群MNS血型GYPA和GYPB的多态性以及建立Diego血型基因分型方法，对比基因和抗原检测结果的相关性，建立适合中国人群的血型基因分型技术，为临床输血医学和血型相关疾病、法医学等领域的研究提供理论依据，并可以有效提高输血保障能力和水平。
方法：
1.　MNS和Diego血型基因检测方法的建立
（1）样本采集：随机选取来自西安市地区的健康无偿献血者，采集静脉血5　ml并以EDTA-K2抗凝保存（310例用于检测MNS血型抗原，610例用于检测Mur抗原，1500例用于检测Diego抗原）。
（2）DNA提取：采用天根全血DNA抽提试剂盒（滤柱法）提取全血组DNA，按试剂操作说明书进行。
（3）PCR扩增：依据基因序列的差别设计引物，扩增GYPA第2、3、4外显子，GYPB第3外显子；根据GYP(B-A-B)Mur与GYPA/GYPB的差异位点设计引物，通过优化条件扩增Mur基因；根据在第19外显子2561位上碱基的差异设计引物，扩增DIA和DIB。
（4）PCR产物测序和比对：将所获PCR扩增产物采用2　%琼脂糖凝胶电泳（200　V，15　min），在紫外灯下观察结果；将扩增产物送交测序，测序引物为扩增引物。测序结果在Genbank数据库比对，测序图用Chramos软件读取。
（5）本检测Mur基因方法与血清学方法结果比对：对检出MUR阳性的样本采用已知的抗-Mur检测，并随机抽取20例MUR基因检测结果为阴性的样本，同样用抗-Mur检测。
（6）本检测Diego基因方法与进口商品试剂检测方法及血清学方法结果比对：采用天津秀鹏和德国Inno-train出品的Diego血型系统基因分型试剂盒进行平行对比，操作按照试剂盒说明书进行，对检出的Di(a+b+)及随机挑选20例Di(a-b+)样本扩增后进行测序。依照抗-Dia的说明书采用间接抗球蛋白法对样本进行血清学方法检测Dia抗原。
2.　MNS和Diego血型基因多态性的检测
（1）MNS的血型基因多态性的检测：用本研究建立的MNS基因分型方法，检测了本地区310例献血者样本，确定其MNS血型。对比了北京及深圳的MNS基因数据。用建立的Mur基因分型方法筛查了本地区610例献血者样本。
（2）Diego血型基因多态性的检测：用本研究建立的Diego基因分型方法，筛查了本地区1500例献血者样本，研究Diego血型基因的多态性。
结果：
1.　MNS和Diego血型基因检测方法的建立
PCR扩增样本GYPA第2、3、4外显子和GYPB第3外显子的产物测序，与标准参照序列进行比对，两者序列完全吻合，证实扩增基因为目的基因。PCR方法扩增Mur（GYP(B-A-B)）产物为988　bp，条带清晰，扩增产物的测序图经比对确认为Mur基因（GYP(B-A-B)）序列；大样本量检测本地区人群Mur基因，对检出的阳性样本和随机抽取的20例阴性样本采用IgM抗-Mur血清学方法检测，结果与基因检测的结果完全吻合。用秀鹏和Inno-train试剂盒检测所有基因型为DI（a+b+）样本及随机挑选20例基因型为DI（a-b+）的样本，结果与本法一致，对样本扩增后测序，测序结果与Genbank上的SLC4A1相关序列进行比对，测序结果显示序列与SLC4A1完全相同,说明扩增产物特异性好，测序结果与基因分型结果一致。用单克隆IgG-Dia采用间接抗球蛋白法对样本红细胞进行检测，与基因分型检测结果一致。以上结果表明，本研究建立的MNS和Diego血型基因检测方法具有很好的特异性，准确可靠，可用于下一步大样本量的研究。
2.　MNS和Diego血型多态性分析
用本研究建立的MNS基因分型方法检测了本地区310例样本中，M+N-　80例，占25.8%；M-N+　84例，占27.1%；M+N+　146例，47.1%；未发现有M-N-样本；S-s+　279例，占90.0%；S+s+　31例，占10.0%；未发现有S+s-及S-s-样本。通过对较大样本的测序检测还发现，GYPA的第3和第4外显子均未发现有新的突变，说明中国人的GYPA的第3和第4外显子序列保守。根据M基因中第1内含子1中有1个G/T突变位点，在M等位基因中又鉴定区分出MG和MT基因，虽然存在这个位置上的突变，但是并未影响血清学即用抗-M的检测结果，说明这个位于内含子的突变对抗原的表达不会产生影响。本研究对比了西安与北京及深圳的相关基因数据，西安地区人群无论M基因的构成比，还是NN纯合子型以及MGMT型、MGN型、MGMG型等特征性的基因型的构成和频率，都存在统计学上的差异，提示这样的差异有可能是地方性基因遗传特征。发现在GYPA第2内含子中有65例样本存在在第59与60位碱基位置插入T碱基引起的碱基移码突变，在西安地区人群中发生率为21.0%（65/310），T碱基的插入不会影响抗原的表达。对GYPB第3外显子的测序后未发现样本中有新的突变，说明西安地区人群的GYPB基因保守。在对610例西安地区人群的检测中，发现9例Mur+样本，并用IgM抗-Mur进行了平行验证。在1500例样本中，共检测到基因型为DI（a+b-）1例，基因型为DI（a+b+）78例，基因型为DI（a-b+）1421例，未检测到DI（a-b-）基因型样本。
结论：
本研究成功建立了MNS和Diego血型的基因检测方法，并利用该方法对西安地区人群MNS和Diego血型的多态性进行了分析，MNS血型以M+N+和S-s+最为常见，Diego血型以DI（a-b+）最为常见。为提高输血安全以及法医学等领域的研究提供了理论依据，具有重要的理论和应用价值。