背景：
急性单核细胞白血病（acute　monocytic　leukemia,　M5）是急性髓性白血病中较常见的类型，临床表现具有髓外浸润、高白细胞计数、完全缓解率低、无病存活时间短、预后差、死亡率高，常规化疗总体疗效有限等特点。免疫治疗是目前最有希望彻底清除白血病微小残留病灶、延长治疗后缓解期、预防复发的疗法，其中肿瘤疫苗已在部分白血病患者中获得肯定疗效。近年来，已有数个被自身特异性细胞毒性T细胞（cytotoxic　tlymphocyte　,　CTL）所识别的肿瘤抗原基因被发现，许多由这些肿瘤抗原基因编码的HLA-I类分子限制性CTL表位也被相继证实。在这些肿瘤抗原基因中，MLAA-22（monocytic　leukemia　associated　antigen-22,　MLAA-22）基因已被证实在急性单核细胞白血病中有高表达，而在正常组织中未见表达。MLAA-22（Genebank登录号：AAQ93061.1）为我室首次报道，它与M5关系密切。
尽管对M5的治疗已取得一些临床进展，但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移的疗效仍不理想。鉴于急性髓系白血病（acute　myeloid　leukemia　,　AML）极差的预后，在化疗或干细胞移植之后，患者十分需要一种新疗法来消除体内残留的白血病细胞以减少复发的危险。靶向作用于白血病相关抗原是一种能改善AML治疗结果、防止复发的免疫治疗方法。白血病相关抗原已显示在白血病患者体内可诱发特异性T细胞免疫反应，因而能够成为特异免疫治疗的潜在靶标。免疫治疗目前虽主要作为临床治疗辅助手段，但被认为是有希望的治疗手段。由于中国AML患者中HLA-A*0201阳性比例较高，因此研究限制性的MLAA-22　HLA-A*0201　抗原表位以诱导针对THP-1细胞的CTL具有十分重要的意义。
目的：
1.　筛选和鉴定白血病相关抗原　MLAA-22　HLA-A*0201　限制性CTL表位，探索基于　MLAA-22　为靶标的白血病免疫治疗的可行性。
2.　研究MLAA-22　抗原表位特异性　CTL　对荷人单核细胞白血病　SCID　小鼠的抑瘤作用。
方法：
1.　采用ProPred-Ⅰ和SYPEITHI两种方法来预测靶抗原　MLAA-22　HLA-A*0201　的限制性　CTL表位；选择预测评分在前10位的10个表位作为候选抗原表位肽，并按照相应基序进行表位肽的人工合成。采用经典的肽结合试验对各个候选抗原表位肽进行亲和力检测，选出亲和力最强的2个抗原表位肽；将2个多肽进行特异性　CTL　体外诱导后，利用LDH释放法检测其CTL活性，选出CTL活性最强的抗原表位肽。
2.　皮下接种　THP1　细胞建立　SCID　小鼠荷人单核细胞白血病模型。用　T2　细胞负载抗原表位肽，反复多次地刺激活化来自　HLA-A*0201　阳性健康志愿者外周血中的单个核细胞（PBMC），并诱导抗原表位肽产生特异性CTL。随机将动物分成5组，每组5只，分别为：①空白对照组[疫苗成份仅为不完全佐剂]；②Th1组[Th1+不完全佐剂]；③灭活的THP1细胞瘤苗组[灭活的THP1细胞瘤苗+Th1+不完全佐剂]；④WT1多肽组[WT1多肽+Th1+不完全佐剂]；⑤多肽治疗组[MLAA1+　Th1+不完全佐剂]。当肿瘤体积约为100mm3时开始腹腔注射疫苗成分，疫苗接种2周后处死SCID小鼠。.采用乳酸脱氢酶法检测脾细胞特异性CTL杀伤活性、肿瘤组织HE染色后镜下观察组织学特点、利用流式细胞仪检测外周血T　细胞亚群及Treg细胞水平、应用ELISA方法检测血清中免疫球蛋白、IL-2、IFN-γ、TGF-β及IL-10水平。
结果：
1.　生物信息学方法预测的前十位候选MLAA-22　CTL表位肽中，总分排在前三位的候选多肽依次为：MLAA2（NLLDLNQKL）、MLAA3（FIYIKIPQV）、MLAA1（LLPNAIYKV）；肽结合试验显示MLAA1和MLAA3具有较高的亲和力，其FI值分别为6.22、4.00，MLAA1和MLAA3可作为候选表位肽进一步分析；
2.　细胞毒实验分析显示：　MLAA1（LLPNAIYKV）在体外最有效地诱导产生特异性CTLs从而杀伤靶细胞，对人单核细胞白血病THP-1细胞的杀伤效应明显高于其他细胞（A549、MCF-7、T2及U937细胞）；
3.　实验成功建立荷人单核细胞白血病SCID小鼠模型，对照组及治疗组中所有动物均成瘤；
4.　不同疫苗成分治疗后SCID小鼠脾细胞对THP1细胞的CTL活性从高到低依次为：MLAA1组＞WT1组＞Th1组＞灭活THP1组＞对照组，MLAA1组与其他治疗组比较，均差异显著（P＜0.05）；MLAA1多肽治疗组SCID小鼠脾细胞对不同肿瘤细胞的CTL活性从高到低依次为：THP1细胞＞U937细胞＞MCF-7细胞＞T2细胞＞A549细胞，多肽治疗组对THP1细胞的CTL杀伤活性最强，THP1细胞与其他细胞比较，均差异显著（P＜0.05）；
5.　MLAA1多肽疫苗诱导的CTL使荷人单核细胞白血病SCID小鼠的肿瘤平均重量及体积均明显缩小，与WT1、Th1、灭活　THP1疫苗及对照组比较，差异显著（P＜0.05）；MLAA1多肽疫苗治疗组肿瘤组织镜下观察发现大量肿瘤细胞变性坏死，存活的肿瘤细胞较少；
6.　SCID小鼠外周血中T细胞亚群检测结果显示MLAA1治疗组CD3+/CD8+免疫分子表达水平明显高于其他治疗组（P＜0.05）；MLAA1治疗组CD3+/CD8+免疫分子表达水平高于CD3+/CD4+水平（P＜0.05），提示MLAA1可明显活化体内CD8+T细胞的免疫效应。
7.　SCID小鼠外周血中Treg细胞的检测结果显示MLAA1组CD4+/CD25+免疫分子表达水平明显低于其他组的CD4+/CD25+水平（P＜0.05），提示MLAA1多肽疫苗明显抑制CD4+/CD25+　Treg水平。
8.　SCID小鼠外周血中IFN-γ、TGF-β、IL-10、IL-2的检测结果显示MLAA1疫苗组的IgG、IFN-γ和IL-2水平均明显高于其他治疗组（P＜0.05），而TGF-β及IL-10水平均明显低于其他治疗组（P＜0.05）。
结论：
1.　MLAA1（LLPNAIYKV）是单核细胞白血病相关抗原MLAA-22的HLA-A*0201限制性CTL表位，可作为特异性免疫治疗的靶分子，为制备基于MLAA-22的治疗性多肽疫苗奠定基础。
2.　MLAA-22　抗原表位　MLAA1（LLPNAIYKV）可在荷人单核细胞白血病　SCID小鼠体内产生特异性CTL免疫反应，有效杀伤白血病细胞。