研究背景：急性髓系白血病（Acute　myeloid　leukemia，AML）是一类严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤。2001年，WHO提倡对白血病进行MICM分型（即根据细胞形态学、免疫学、遗传学、分子生物学特征分型），着重提出了肿瘤细胞中非随机染色体异常及其分子改变与特定白血病亚型的临床表现、生物学特性之间的密切联系，并在此基础上开展新的治疗手段。急性单核细胞白血病(M5)是一种特殊类型的急性髓系细胞白血病，主要诊断指标为骨髓原单核、幼单核及单核细胞比例≥80%。该型白血病易伴发髓外浸润，大多数临床进程凶险，缓解后复发率高，3年平均无病生存率仅有25％。迄今为止急性单核细胞白血病尚未找到确定的特异性分子标记物。前期我课题组已运用重组cDNA表达文库血清学分析法（Serological　Identification　of　antigens　by　recombinant　expression　cloning，SEREX）对单核细胞白血病细胞株U937进行急性单核细胞白血病相关抗原筛选，得到35个新抗原基因，其中MLAA-34基因是具有代表性的基因之一。通过慢病毒载体稳定转染U937细胞株过表达MLAA-34基因发现MLAA-34在U937细胞中具有抗凋亡作用，抑制MLAA-34基因的表达可引起U937细胞凋亡增加。运用Western　blot对MLAA-34抗原在多种肿瘤细胞株及非肿瘤细胞株和5种混合正常组织细胞（如正常人外周血单个核细胞，小鼠脾细胞等）的表达谱进行研究，发现MLAA-34抗原在U937及肝癌细胞株MHCC97-H中高表达，在具高侵袭能力的肿瘤细胞株如结肠癌细胞株HCT116中表达较强。前期临床病例资料分析示MLAA-34表达水平在M5伴髓外病变的患者相较于M5无髓外病变的患者和非M5其它的AML患者明显增高（P＜0.05），且髓外浸润与MLAA-34表达水平为AML患者独立预后因素。进一步研究MLAA-34在肺癌、结肠癌及胃癌均有极少数病例表达MLAA-34蛋白且这些患者生存期明显缩短。
总之，通过前期研究发现MLAA-34在白血病髓外浸润方面可能发挥作用，　MLAA-34可能与肿瘤转移相关；由于前期研究MLAA-34基因在血液及实体肿瘤细胞株表达情况并未全面覆盖，需要进一步探讨MLAA-34在不同肿瘤细胞株中表达情况，尤其是通过相同肿瘤不同程度侵袭性细胞株的对照，探讨MLAA-34表达是否与肿瘤侵袭相关。
MLAA-34作为新型鉴定的白血病肿瘤相关抗原之一，其晶体结构及抗凋亡作用机制均不明确，通过生物信息学的比对发现MLAA-34基因是一种钙离子结合39样蛋白（Calcuim　binding　protein　39-like,　CAB39L）的同源剪接变异体。其中CAB39L蛋白又称Mo25β（Mouse　protein　25β），属于Mo25相关蛋白（mouse　protein25）家族，该家族中蛋白氨基酸序列及结构具有同源性、相似性。人类基因所编码的Mo25相关蛋白分别为Mo25β（CAB39L）及Mo25α（CAB39），二者具有79%同源性。Mo25α蛋白连接LKB1（liver　kinase　B1）/STRAD（STE20　related　adaptor　protein）复合物，Mo25α的桥连作用使LKB1的活性提高近10倍，调节、激活LKB1核心激酶的活性，发挥调节细胞增殖、分化的作用，起到抑癌作用。研究表明CAB39L基因翻译蛋白Mo25β也可以与LKB1结合发挥生理功能，而二者是否具有相互竞争关系而影响肿瘤细胞生长、增殖及迁移需要进一步探讨。
研究目的：
1.　检测急性髓系白血病患者MLAA-34表达，分析表达水平与髓外浸润的关系。
2.　检测MLAA-34在血液肿瘤细胞株及实体肿瘤细胞株中转录水平及蛋白的水平情况，分析高、低侵袭性不同的实体肿瘤细胞株MLAA-34的表达差异与肿瘤细胞株侵袭性的相关性。
3.　构建抑制MLAA-34的转染U937细胞株，通过Transwell侵袭实验探讨MLAA-34与侵袭转移的相关性。
4.　检测CAB39在肿瘤细胞中蛋白表达与MLAA-34蛋白表达情况，初步探讨MLAA-34与Mo25蛋白家族的关系。
5.　检测MLAA-34在正常单核细胞中表达量，探讨MLAA-34在单核细胞中表达的特异性。
研究方法：收集52例初发AML患者及14例健康志愿者骨髓或外周血标本，构建基于Taqman探针技术的实时荧光定量RT-PCR（Real-time　PCR）方法对正常对照以及AML患者的MLAA-34　mRNA进行检测；采用实时定量PCR及蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测单核细胞性白血病细胞系（U937，THP1）、粒细胞性白血病细胞系（NB4、K562）、淋巴细胞性白血病细胞系（Jurkat、RS4;11）、多发性骨髓瘤细胞系（RPMI　8226，U266，H929）、肺癌细胞系（A549，PC9，H1675）、肝癌细胞系（Hep-3B、SMMC-7721、MHCC97-H）、乳腺癌细胞系（MCF7、MDA-MB　231）、结肠癌细胞系（SW480、SW620）MLAA-34mRNA及蛋白表达水平；分离正常人外周血单核细胞，通过实时定量PCR及Western-blot检测正常单核细胞MLAA-34表达量；构建沉默MLAA-34表达的U937细胞株，通过Transwell侵袭实验探讨MLAA-34对U937细胞株转移的影响。
研究结果：
1.　在急性髓系白血病患者中髓外浸润以淋巴结肿大为主，不同亚型急性髓系白血病患者均可见白血病髓外浸润，且以急性粒单细胞白血病（M4）及M5发生髓外浸润的比例高。在髓外浸润组骨髓中MLAA-34表达量高于无髓外浸润组，表达水平的差异具有统计学意义。
2.　在血液恶性肿瘤细胞系中MLAA-34在转录水平及蛋白水平上均在急性单核细胞系高表达，而在粒系、淋巴系、骨髓瘤系表达水平低。在实体肿瘤细胞系中MLAA-34在转录及蛋白水平上均为低表达，但在高转移性结肠癌细胞系（SW620）、高转移性肝癌细胞系（MHCC97-H）及高转移性乳腺癌细胞株（MDA-MB　231）较其低转移潜能细胞株SW480、SMMC7721、Hep-3B，MCF7中呈现相对高表达，具有统计学意义。在肺癌细胞株（A549，PC9，H1975）为低水平表达。
3.　MLAA-34在U937及THP1细胞株的表达明显高于NB4、K562细胞株的表达水平，比较髓系细胞侵袭能力发现U937与THP1细胞侵袭能力高于NB4以及K562，通过构建稳定沉默MLAA-34的U937细胞株在Transwell侵袭实验中可以发现，MLAA-34沉默后U937细胞Transwell下室细胞数小于空载组及阴性对照组，MLAA-34表达水平下降后会导致U937细胞侵袭能力下降。通过线性回归关系分析各系细胞株之间MLAA-34　mRNA的量与下室细胞计数之间的相关性，发现两者具有线性正相关（r=0.978），具有统计学意义（P＜0.05）。
4.　通过回归性分析发现在MLAA-34相对蛋白表达量与CAB39相对蛋白表达量之间无明显线性关系（r=0.316,P＞0.05），但通过散点图可以看出U937、THP1等急性单核系白血病细胞系表达CAB39及MLAA-34均相对高表达，其中CAB39蛋白在各系肿瘤细胞高转移潜能细胞株与低转移潜能细胞株均有表达，但未见明显差异。
5.　在转录及蛋白水平上MLAA-34基因在正常单核细胞中均为低表达。
研究结论：
1.　MLAA-34在伴有髓外浸润AML患者相对高表达，MLAA-34在单核细胞系肿瘤系较其他肿瘤细胞系特异性高表达，但MLAA-34在高侵袭性肿瘤细胞株较其对应低转移潜能细胞株相对高表达，MLAA-34　mRNA表达水平与细胞侵袭力呈正相关。
2.　通过体外侵袭实验证明，抑制MLAA-34表达可减弱U937细胞的侵袭能力。
3.　MLAA-34蛋白水平与CAB39无关，说明MLAA-34可能不是通过LKB1信号途径调控肿瘤侵袭。