目的：

1）建立HUCB-MSCs体外培养体系，为组织工程探寻提供新的种子细胞来源，为骨组织工程中进一步人工成骨研究提供一定基础。

2）研究HUCB-MSCs的细胞形态，生长周期及免疫表型等生物学特性，考察培养条件中不同血清浓度对体外培养HUCB-MSCs生长状态的影响。

3）研究HUCB-MSCs早期传代细胞经体外诱导后成骨向分化能力，并探讨其成骨活性及成骨功能。

4）初步探讨HUCB-MSCs早期传代细胞成软骨及成脂肪向定向分化能力，验证HUCB-MSCs多向分化潜能并进一步证明由本培养体系获得的脐血来源的细胞是间充质干细胞。

方法：

1）采集脐带血标本，体外分离培养HUCB-MSCs。实验采用α-MEM培养基，以培养基中血清含量不同分为三组：10%血清组，15%血清组，20%血清培养组。倒置相差显微镜下分别观察三组原代细胞的生长状况及形态特点，免疫组化法鉴定其表型。每隔3天对原代MSCs进行计数并对数据进行统计学分析。

2）对15%组原代HUCB-MSCs进行传代，观察传代细胞形态学及生长特点。

3）将HUCB-MSCs早期传代细胞进行成骨向诱导，诱导2周后通过茜素红染色检测钙化结节，并进行ALP染色及ALP活性测定。

4）将HUCB-MSCs早期传代细胞进行成软骨向诱导，诱导3周后通过甲苯胺蓝染色检测软骨样细胞诱导结果。

5）将HUCB-MSCs早期传代细胞进行成脂肪向诱导，诱导3周后通过油红O染色检测脂肪样细胞诱导结果。

结果：

1）细胞接种培养48h后贴壁。15d后多种形态细胞共同贴壁生长，贴壁细胞形态主要分为4种：星形细胞，梭形成纤维样细胞，扁平状细胞和小圆形细胞。3组细胞培养30天时，扁平细胞数量随血清浓度升高而递增。G2组、G3组细胞对数期峰值均高于G1组有统计学意义，G3与G2组间细胞数差异无统计学意义。但　G3组中多数细胞趋于老化并最终死亡。4种形态的原代HUCB-MSCs均CD44，CD105表达呈阳性，CD34,CD45表达呈阴性。

2）HUCB-MSCs成骨诱导14d后，茜素红染色可见红色的钙化基质沉积，ALP染色呈阳性，诱导15d时ALP活性最强。

3）HUCB-MSCs成软骨诱导3周后，甲苯胺蓝染色显示阳性。

4）HUCB-MSCs成脂肪诱导3周后，油红染色显示细胞胞质中可见红色脂滴。

结论：

1）本实验成功建立了HUCB-MSCs体外培养体系；α-MEM培养基适于HUBC-MSCs原代培养及其早期传代细胞成骨分化实验。

2）　血清浓度是培养体系中影响细胞特性的一个重要因素,　含有15%FBS的α-MEM培养体系利于原代与传代细胞培养及成骨诱导分化实验。

3）原代HUCB-MSCs存活能力较强，但增殖活性略低，能达到稳定增殖的时间较长。

4）HUCB-MSCs细胞具备四种不同形态，且四种细胞免疫表型具有一致性，可能为HUCB-MSCs的四种亚型。

5）HUCB-MSCs早期传代细胞经成骨向诱导可显示出成骨样细胞的特性并具备一定成骨功能。

6）HUCB-MSCs早期传代细胞经成软骨向及成脂肪向定向诱导可分化为成软骨样细胞与成脂肪样细胞，充分说明该细胞群具有多向分化能力，并进一步证明由该培养体系获得的脐血来源的目的细胞确实为具备多向分化潜能的MSCs。



关　键　词：脐血；间充质干细胞；细胞形态；体外培养；成骨样细胞；成软骨样细胞；

成脂肪样细胞

论文类型：应用基础