流行病学研究，我国约有600万以上的癫痫患者，每年新发病者为65~70万，经过正规药物治疗后80　%左右患者的发作得到有效控制，但仍有约15~20%的患者为难治性癫痫（RE），反复难以控制的癫痫发作仍然是影响健康和造成癫痫患者死亡的重要原因。RE耐药机制和有效治疗途径的探讨是目前小儿神经系统疾病防治伤残研究的重要课题。RE耐药机制尚不明确，有研究发现，多药转运体P-糖蛋白（P-glycoprotein　，P-gp）（多药耐药基因表达产物）及多药耐药相关蛋白（multidrug　resistance-associated　protein　，MRP）与癫痫发作和药物转运密切相关。癫痫手术切除的脑组织星形胶质细胞增生与多药耐药基因（MDR）等过度表达同时存在。胶质纤维酸性蛋白（glial　fibrillary　acidic　protein　,　GFAP）作为星形胶质细胞特异性标记物，其表达水平可判定细胞增生情况，星形胶质细胞增生与癫痫的复发密切相关。慢性癫痫病人星形胶质细胞反复激活并增生，同时脑脊液和脑组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量升高。免疫学研究中发现TNF-α可能参与癫痫的病理机制。在许多研究中，都使用TNF-α作为星形胶质细胞的激活物，但并未研究星形胶质细胞在此种情况下MDR、MRP的表达情况。本实验旨在探讨肿瘤坏死因子（TNF-α）对体外培养的的星形胶质细胞的激活作用及不同激活程度的星形胶质细胞多药耐药基因（MDR）及多药耐药相关蛋白（MRP1）表达的影响，为进一步对难治性癫痫多药耐药现象的研究提供实验室依据。本文针对以上问题进行研究，取生后两日内的大鼠皮层进行星形胶质细胞的原代和传代培养并纯化鉴定后，在第6-8代细胞使用肿瘤坏死因子及肿瘤坏死因子siRNA加入培养基中继续培养，得到不同增生程度的星形胶质细胞，通过MTT法判断细胞增生程度后，采用RT-PCR法、Western-Blot法和免疫细胞化学法检测多药耐药基因（MDR1）/　P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药基因相关蛋白（MRP1）以及核因子-κB（NF-κB）的不同表达情况。得到了以下结果：

1、成功分离纯化并传代出大鼠脑皮层星形胶质细胞，倒置相差显微镜下观察，在种植1h后，细胞开始贴壁，6　h后大部分细胞已贴壁,24　h后,所有细胞均已贴壁,光晕明显。至9～14d,细胞完全融合，经恒温摇床震荡去除混杂细胞收集贴壁细胞传代后,星形胶质细胞的比例增大。应用免疫荧光方法,　荧光显微镜下镜检,　GFAP阳性细胞占所有细胞光镜下的比例为95%以上,完全可以用于下游实验。

2、肿瘤坏死因子可以激活星形胶质细胞表现为细胞增生，分泌众多细胞因子和NF-κB表达上调等，且有一定时间关系，加入肿瘤坏死因子后2小时细胞开始增殖，24小时达高峰，48小时下降。转染肿瘤坏死因子siRNA，干扰内源性肿瘤坏死因子后星形胶质细胞增殖程度明显下降。

3、最佳TNF-α干扰序列为SIRNA-02-F:　5’-AGACAACCAACUGGUGGUAdTdT　-3’,　SIRNA-02-R:　5’-　UACCACCAGUUGGUUGUCUdTdT　-3’，最优配比为脂质体1μ，siRNA　0.5μg（约2μl），此时细胞活力被脂质体的毒性干扰较小，且转染效率最高。

4、在生理情况下，星形胶质细胞上的MRP1表达高于P-gp，而当病理情况下，胶质细胞激活，MDR1/P-gp表达迅速上升且上升幅度高于MRP1。说明正常情况下，MRP1在胶质细胞的物质转运中起主要作用，而在疾病发生时，以MDR1/P-gp表达升高为主，参与药物耐药现象的发生。

5、激活的胶质细胞可能通过上调NF-κB水平调节MDR1/P-gp及MRP1表达水平。MDR1在各个时间点均可检测到，在TNF-α干预两小时后有明显上升，至24小时时达高峰，而到48小时，则开始下调，对于经TNF-αsiRNA干扰的一组，可见其明显下调，与对照组灰度相比，差别有统计学意义。在各时段，MRP1也可以检测到，但在TNF-α干预两小时后有明显下降，后开始上升，24小时后到达高峰，48小时下调，同时经RNA干扰组可见明显的下降，与对照组相比，差别有统计学意义。TNF-α作用2小时后，NF-κB显著升高，到24小时达到顶峰，48小时下降，与对照组相比，差别有统计学意义，说明星形胶质细胞被TNF-α激活，TNF-α可以导致NF-κB表达变化，这之间有时间关系。

结论：肿瘤坏死因子对体外培养的星形胶质细胞有一定的激活作用，抑制了内源性的肿瘤坏死因子后，对星形胶质细胞的激活也减少。激活的星形胶质细胞可能通过上调NF-κB水平调节MDR1/P-gp及MRP1表达水平，可能参与了难治性癫痫的形成。通过调节细胞因子水平或者从胶质细胞出发或许可以为难治性癫痫发病机制和治疗的研究提供了一个新方向。