神经干细胞(NSCs)是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，在一定条件下能可被诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经营养因子（NTs）是一类能够促进神经细胞存活、生长和分化的蛋白质因子，它包括神经生长因子（NGF）、脑源性生长因子（BDNF）、神经营养素3（NT-3）及神经营养素4/5（NT-4/5）等，其中NT-3与神经系统的发育关系密切，且其作用方式可能与其它神经营养因子不同。研究证实NT-3能促进NSCs存活、增殖、向神经元分化以及神经元突起的生长，而且能够保护受损的神经细胞，诱导神经细胞再生，从而促进损伤修复和功能重建。多种因素参与对NSCs的存活、增殖、分化等行为的调控。微小RNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA　分子，目前被认为是细胞内调控基因表达的重要成分。它通过与目标mRNA的3’UTR互补配对，在转录后或翻译2个水平负性调控靶基因的表达，实现对细胞存活、增殖、凋亡、分化和新陈代谢的调节。近年来miRNA在干细胞行为以及功能调控中的作用备受关注，也有研究证实部分miRNA可能参与神经营养因子的功能发挥。有关NT-3的作用过程中有哪些miRNA参与、它们如何发挥其调控作用等问题，目前并不清楚。本研究拟通过miRNA芯片分析技术筛选参与NT-3功能调控的候选miRNA，以实时定量PCR（Real　time　PCR）对候选miRNA进行验证，并结合文献选定目标miRNA，进一步构建重组慢病毒载体，介导目标miRNA在NSCs内高表达，通过观察NSCs生物学行为变化，分析其对NSCs的影响以及与NT-3作用的关系。研究方法：（1）分离培养胚胎14.5　d的大鼠皮质NSCs，用不同浓度（100　ng/ml，50　ng/ml，20　ng/ml）NT-3对传至第2~5代NSCs进行处理，于处理后不同时间（1　d~7　d）进行细胞计数，绘制细胞增殖曲线，筛选确定NT-3的作用浓度及时间；（2）以选定浓度的NT-3处理培养的NSCs，分别于处理后24　h和48　h提取细胞总RNA，进行miRNA芯片分析；（3）根据芯片分析结果，筛选候选miRNA，设计相应引物，对候选miRNA进行Real　time　PCR验证；（4）结合Real　time　PCR验证结果及文献报道，确定miR-500为目标miRNA，并构建携带目标miRNA以及增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组慢病毒载体，包装病毒；（5）以重组慢病毒感染NSCs，倒置荧光显微镜下观察病毒感染效果，流式细胞仪检测病毒感染效率，CCK-8（Cell　Counting　Kit-8）测定病毒感染对NSCs活力的影响；（6）Real　time　PCR定量检测慢病毒感染后NSCs内miR-500的表达水平，　CCK-8连续测定不同培养时间NSCs活力及增殖情况，Annexin　V凋亡试剂盒检测NSCs凋亡情况，流式细胞仪检测NSCs周期变化，免疫细胞化学染色及western　blot定量检测分化后细胞nestin、β-tubulin　Ⅲ和GFAP蛋白表达观察细胞分化情况，动态测量诱导分化后7　d、14　d细胞最长突起长度以评价细胞突起的延伸。实验结果：（1）分离获得的大鼠胚胎皮质NSCs体外培养时可以不断增殖形成神经球，90%以上的细胞为nestin阳性；在1%胎牛血清（FBS）诱导下NSCs发生多向分化，分别分化为β-tubulin　Ⅲ阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞；（2）不同浓度的NT-3作用后，NSCs体外生长状态不同，其中100　ng/ml与50　ng/ml的NT-3作用组NSCs增殖活跃，细胞活力显著高于20　ng/ml浓度组及对照组，并且50　ng/ml的NT-3作用后NSCs仍然以悬浮生长为主，而100　ng/ml的NT-3作用组细胞主要以贴壁生长为主；因此选定50　ng/ml为NT-3后续工作浓度；（3）miRNA芯片分析结果显示NT-3作用24　h和48　h后共有1455个miRNA表达发生改变，其中NT-3作用24小时上调2倍以上的miRNA共有16个，最高上调16.4倍，2倍以上下调miRNA共有38个，最高下调100倍；NT-3作用48小时上调2倍以上的miRNA共有12个，最高上调3.4倍，2倍以上下调miRNA共有6个，最高下调74倍；（4）芯片分析结果结合文献，选出10条miRNA作为候选miRNA进行Real　time　PCR验证，结果与芯片分析并不完全一致，其中miR-500与芯片结果趋势一致，表达均明显下调，且重复性好，因此选定miR-500为目标miRNA；（5）携带目标miRNA和EGFP基因的重组慢病毒感染NSCs后24　h，荧光显微镜下可见明显的绿色荧光，72　h后更为显著；流式细胞仪定量检测显示病毒感染72　h时约有91.67%的细胞被成功感染；（6）慢病毒感染后NSCs活力与对照组相比明显下降，但感染细胞仍保持多向分化能力；（7）携带目标miRNA的重组慢病毒感染后NSCs内miR-500表达水平显著上调，为对照组的77倍；与对照组相比，重组慢病毒感染组NSCs活力、凋亡细胞比例、细胞增殖指数、S期细胞比例均无明显改变；（8）经1%FBS诱导后14　d，约有39%的重组慢病毒感染细胞分化为β-tubulin　Ⅲ阳性神经元，51%的细胞分化为GFAP阳性星形胶质细胞，仍有15%左右的细胞为nestin阳性未分化细胞，与对照组相比无显著性差异；对照组和病毒感染组细胞在诱导分化7　d时平均突起长度为138.6±9.8　μm和135.3±8.6　μm，在分化后14　d时平均突起长度分别为168.5±5.4　μm和182.7±14.9　μm，两组相比无显著性差异。研究结论：（1）芯片分析结果显示NT-3作用后NSCs内多种miRNA表达发生改变，部分表达上调，也有部分miRNA表达下调，提示在NT-3影响NSCs生物学行为的过程中有miRNA的参与；（2）NT-3（50　ng/ml）作用24h后miR-500表达水平显著下调，提示NT-3可能通过下调miR-500对其靶标mRNA的抑制完成对NSCs增殖、分化的影响；（3）慢病毒介导miR-500在NSCs内的高表达后细胞增殖指数下降、细胞突起长度增加，证实miR-500参与对NSCs增殖、分化的调控，但未显著改变NSCs生物学行为，可能与miRNA“一对多、多对一”的作用特点有关。关　键　词：神经营养素3；神经干细胞；miRNA论文类型：基础研究