Abstract:
神经干细胞(NSCs)是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞,在一定条件下能可被诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经营养因子(NTs)是一类能够促进神经细胞存活、生长和分化的蛋白质因子,它包括神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子(BDNF)、神经营养素3(NT-3)及神经营养素4/5(NT-4/5)等,其中NT-3与神经系统的发育关系密切,且其作用方式可能与其它神经营养因子不同。研究证实NT-3能促进NSCs存活、增殖、向神经元分化以及神经元突起的生长,而且能够保护受损的神经细胞,诱导神经细胞再生,从而促进损伤修复和功能重建。多种因素参与对NSCs的存活、增殖、分化等行为的调控。微小RNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA 分子,目前被认为是细胞内调控基因表达的重要成分。它通过与目标mRNA的3’UTR互补配对,在转录后或翻译2个水平负性调控靶基因的表达,实现对细胞存活、增殖、凋亡、分化和新陈代谢的调节。近年来miRNA在干细胞行为以及功能调控中的作用备受关注,也有研究证实部分miRNA可能参与神经营养因子的功能发挥。有关NT-3的作用过程中有哪些miRNA参与、它们如何发挥其调控作用等问题,目前并不清楚。本研究拟通过miRNA芯片分析技术筛选参与NT-3功能调控的候选miRNA,以实时定量PCR(Real time PCR)对候选miRNA进行验证,并结合文献选定目标miRNA,进一步构建重组慢病毒载体,介导目标miRNA在NSCs内高表达,通过观察NSCs生物学行为变化,分析其对NSCs的影响以及与NT-3作用的关系。研究方法:(1)分离培养胚胎14.5 d的大鼠皮质NSCs,用不同浓度(100 ng/ml,50 ng/ml,20 ng/ml)NT-3对传至第2~5代NSCs进行处理,于处理后不同时间(1 d~7 d)进行细胞计数,绘制细胞增殖曲线,筛选确定NT-3的作用浓度及时间;(2)以选定浓度的NT-3处理培养的NSCs,分别于处理后24 h和48 h提取细胞总RNA,进行miRNA芯片分析;(3)根据芯片分析结果,筛选候选miRNA,设计相应引物,对候选miRNA进行Real time PCR验证;(4)结合Real time PCR验证结果及文献报道,确定miR-500为目标miRNA,并构建携带目标miRNA以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,包装病毒;(5)以重组慢病毒感染NSCs,倒置荧光显微镜下观察病毒感染效果,流式细胞仪检测病毒感染效率,CCK-8(Cell Counting Kit-8)测定病毒感染对NSCs活力的影响;(6)Real time PCR定量检测慢病毒感染后NSCs内miR-500的表达水平, CCK-8连续测定不同培养时间NSCs活力及增殖情况,Annexin V凋亡试剂盒检测NSCs凋亡情况,流式细胞仪检测NSCs周期变化,免疫细胞化学染色及western blot定量检测分化后细胞nestin、β-tubulin Ⅲ和GFAP蛋白表达观察细胞分化情况,动态测量诱导分化后7 d、14 d细胞最长突起长度以评价细胞突起的延伸。实验结果:(1)分离获得的大鼠胚胎皮质NSCs体外培养时可以不断增殖形成神经球,90%以上的细胞为nestin阳性;在1%胎牛血清(FBS)诱导下NSCs发生多向分化,分别分化为β-tubulin Ⅲ阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞;(2)不同浓度的NT-3作用后,NSCs体外生长状态不同,其中100 ng/ml与50 ng/ml的NT-3作用组NSCs增殖活跃,细胞活力显著高于20 ng/ml浓度组及对照组,并且50 ng/ml的NT-3作用后NSCs仍然以悬浮生长为主,而100 ng/ml的NT-3作用组细胞主要以贴壁生长为主;因此选定50 ng/ml为NT-3后续工作浓度;(3)miRNA芯片分析结果显示NT-3作用24 h和48 h后共有1455个miRNA表达发生改变,其中NT-3作用24小时上调2倍以上的miRNA共有16个,最高上调16.4倍,2倍以上下调miRNA共有38个,最高下调100倍;NT-3作用48小时上调2倍以上的miRNA共有12个,最高上调3.4倍,2倍以上下调miRNA共有6个,最高下调74倍;(4)芯片分析结果结合文献,选出10条miRNA作为候选miRNA进行Real time PCR验证,结果与芯片分析并不完全一致,其中miR-500与芯片结果趋势一致,表达均明显下调,且重复性好,因此选定miR-500为目标miRNA;(5)携带目标miRNA和EGFP基因的重组慢病毒感染NSCs后24 h,荧光显微镜下可见明显的绿色荧光,72 h后更为显著;流式细胞仪定量检测显示病毒感染72 h时约有91.67%的细胞被成功感染;(6)慢病毒感染后NSCs活力与对照组相比明显下降,但感染细胞仍保持多向分化能力;(7)携带目标miRNA的重组慢病毒感染后NSCs内miR-500表达水平显著上调,为对照组的77倍;与对照组相比,重组慢病毒感染组NSCs活力、凋亡细胞比例、细胞增殖指数、S期细胞比例均无明显改变;(8)经1%FBS诱导后14 d,约有39%的重组慢病毒感染细胞分化为β-tubulin Ⅲ阳性神经元,51%的细胞分化为GFAP阳性星形胶质细胞,仍有15%左右的细胞为nestin阳性未分化细胞,与对照组相比无显著性差异;对照组和病毒感染组细胞在诱导分化7 d时平均突起长度为138.6±9.8 μm和135.3±8.6 μm,在分化后14 d时平均突起长度分别为168.5±5.4 μm和182.7±14.9 μm,两组相比无显著性差异。研究结论:(1)芯片分析结果显示NT-3作用后NSCs内多种miRNA表达发生改变,部分表达上调,也有部分miRNA表达下调,提示在NT-3影响NSCs生物学行为的过程中有miRNA的参与;(2)NT-3(50 ng/ml)作用24h后miR-500表达水平显著下调,提示NT-3可能通过下调miR-500对其靶标mRNA的抑制完成对NSCs增殖、分化的影响;(3)慢病毒介导miR-500在NSCs内的高表达后细胞增殖指数下降、细胞突起长度增加,证实miR-500参与对NSCs增殖、分化的调控,但未显著改变NSCs生物学行为,可能与miRNA“一对多、多对一”的作用特点有关。关 键 词:神经营养素3;神经干细胞;miRNA论文类型:基础研究
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Degree: 医学硕士
Mentor: 吕海侠
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Year: 2013
Language: Chinese
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