研究目的及意义：视网膜神经退行性疾病如年龄相关性黄斑变性（Age　related　macular　degeneration,　AMD），青光眼（Glaucoma）等是一类致盲率极高的严重影响人类身体健康和生活质量的疾病。氧化应激（oxidative　stress）损伤诱导产生视网膜神经细胞（retinal　nerve　cell,　RNC）凋亡是视网膜神经退行性疾病产生的一个重要原因。近年来发现，17β-雌二醇（17β-estradiol,　E2）在中枢神经系统（central　nervous　system,　CNS）中具有抗凋亡、抗氧化及增加神经营养等方面的保护作用，但是这种保护作用的机制目前还不甚清楚，特别是E2在RNC中抗凋亡保护作用的研究鲜见报道。本项研究通过利用氧化应激诱导SD大鼠RNC凋亡的研究模型，检测线粒体凋亡通路及toll　样受体（toll-like　receptors,　TLRs）介导的免疫炎症反应在RNC凋亡过程中的作用，进而观察并研究E2抗凋亡的神经保护作用及其分子机制,　阐明E2抗氧化应激损伤的神经保护作用与抗线粒体凋亡通路以及TLRs介导的免疫炎症反应之间的关系。E2抗凋亡的神经保护作用机制的阐明对于雌激素样新药的研发，以及与视网膜神经退行性疾病及其他中枢神经退行性疾病相关的重要靶分子的筛选及相应疾病的治疗均具有重要的作用。内容及结果（第一部分）：本研究在体外H2O2诱导原代培养的SD大鼠RNC凋亡的研究模型基础上，利用电镜观察、real-time　PCR、Western　blot及线粒体膜势能（mitochondrial　membrane　potential，∆Ψm）检测等技术，通过检测凋亡及与线粒体凋亡通路密切相关的Bcl-2及caspase家族的关键成员分子，观察H2O2诱导SD大鼠RNC凋亡以及E2抗凋亡的神经保护作用，进而研究E2抗氧化应激损伤的神经保护作用与抗线粒体凋亡通路之间的关系，并在此基础上利用3-磷酸肌醇激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）的抑制剂LY294002（LY）进一步研究E2对RNC的保护作用是否可通过激活PI3K信号通路来实现。已取得的实验研究结果主要包括如下5个方面：1.　H2O2可导致大鼠RNC活力显著下降，细胞尼氏体数目显著减少；E2预保护组相对于H2O2损伤组，细胞活力显著回升，细胞尼氏体数目显著增加。实验结果说明E2可保护RNC免受H2O2诱导的氧化应激损伤。2.　H2O2诱导大鼠RNC凋亡，电镜检测结果观察到细胞染色质边集，细胞固缩变形以及凋亡小体的产生等凋亡特征；E2预保护组相对于H2O2组，细胞的凋亡程度明显下降。实验结果说明E2可减少H2O2诱导的RNC的凋亡，从而保护RNC免受氧化应激损伤。3.　E2可显著地增强Akt的活化；LY的干预则可显著地抑制E2所介导的Akt的活化，而对Akt　mRNA的转录及蛋白表达水平无显著影响。实验结果说明E2可显著活化PI3K/Akt信号通路。4.　LY可抑制E2抗H2O2损伤的RNC的保护作用，显著降低细胞的活力，增加细胞的凋亡百分比。实验结果说明E2可通过激活PI3K/Akt信号通路发挥其抗H2O2诱导凋亡的RNC的保护作用。5.　E2可显著抑制由H2O2诱导产生的Bax表达，caspase　9/3的活化，∆Ψm的下降及线粒体细胞色素c（cytochrome　c,　Cyt-c）的释放，LY则可抑制E2所发挥的上述作用。实验结果说明E2可通过激活PI3K/Akt信号通路抑制H2O2诱导的Bax所介导的线粒体凋亡通路发挥RNC的保护作用。内容及结果（第二部分）：本研究在体外H2O2及在体光诱导SD大鼠RNC凋亡的研究模型基础上，利用real-time　PCR、Western　blot、Annexin-V　FITC/PI染色流式细胞仪凋亡检测、配体刺激、小分子RNA干扰（small　RNA　interference，siRNA）等技术，检测并确定在氧化应激损伤诱导RNC凋亡过程中TLR2所发挥的重要作用，并在此基础上观察E2抗TLR2介导凋亡的神经保护作用。通过利用LY进行PI3K信号通路的抑制剂干预实验，以揭示E2抗TLR2介导的免疫炎症反应诱导的凋亡抵御氧化应激损伤的RNC的保护作用与PI3K信号通路之间关系。已取得的实验研究结果主要包括如下6个方面：1.　TLRs的9种亚型，TLR1-TLR9均在大鼠RNC中有不同程度的表达，其中TLR2表达相对较高。2.　H2O2可显著上调TLR2的表达，该上调作用在48h内随着刺激时间的延长而加强；TLR2的表达呈现出对H2O2浓度的依赖趋势，其中200　μM　H2O2对TLR2表达的上调作用最强。3.　E2可显著降低由H2O2诱导的TLR2及炎性细胞因子TNF-ɑ，IFN-γ，IL-1β的表达；在体光损伤可明显上调RNC中TLR2的表达，E2预保护后TLR2表达下调至接近对照组的水平。实验结果说明体外H2O2及在体光诱导大鼠RNC凋亡的模型中，氧化应激损伤可导致RNC中TLR2表达上调，E2可能是通过降低TLR2介导的免疫炎症反应发挥对RNC的保护作用。4.　TLR2的小分子RNA干扰（siTLR2）实验的结果表明：siTLR2-971和siTLR2-316干扰序列的干扰效果较为明显；上述干扰序列均可显著降低由H2O2介导的大鼠RNC的凋亡；siTLR2-316可显著降低由H2O2引起的大鼠RNC中细胞因子TNF-ɑ，IFN-γ，IL-1β的表达。实验结果说明TLR2表达的下调可通过降低TLR2下游炎性细胞因子TNF-ɑ，IFN-γ，IL-1β的表达来保护RNC免受H2O2诱导的凋亡损伤。5.　TLR2的配体肽聚糖（peptidoglycan,　PGN）的刺激实验结果表明：与H2O2单独作用组相比，PGN与H2O2共同作用组RNC凋亡数显著减少，然而细胞坏死数则显著增加；E2预处理组与E2及PGN共同作用组相比，RNC凋亡数显著减少。说明激活TLR2信号通路可促使H2O2诱导的RNC从凋亡向坏死转化，从而加速细胞的死亡，而E2则可以通过抑制TLR2所介导的凋亡保护RNC免受氧化应激损伤。上述实验结果进一步表明TLR2在H2O2诱导RNC凋亡的过程中发挥重要的作用。6.　LY对E2下调H2O2介导的大鼠RNC中TLR2的表达无显著影响。实验结果说明E2抑制TLR2介导的RNC的凋亡抗氧化应激损伤的保护作用并非是通过PI3K信号通路实现的。主要结论：1.　E2可通过激活PI3K/Akt信号通路抑制Bax相关的线粒体凋亡通路,保护原代培养的SD大鼠RNC免受H2O2诱导的凋亡损伤。2.　E2可通过非PI3K/Akt信号通路依赖的途径抑制TLR2介导的免疫炎症反应，降低相关炎性细胞因子TNF-ɑ，IFN-γ，IL-1β的表达，从而保护大鼠RNC免受氧化应激诱导产生的凋亡。