摘　　要
研究背景：
牙周炎是发生在牙周支持组织的炎性、破坏性疾病，现已经成为我国成年人牙齿丧失的首要原因。牙周炎治疗的理想目标是获得牙周组织的完全再生并恢复其形态和功能，然而临床实践中现有的治疗方法尚不能获得完全而有效的牙周组织再生。牙周组织修复过程中，充足的血供不仅能为参加组织再生的各种细胞提供氧、信号分子以及营养，还能带走炎性代谢废物与降解产物，有助于牙周组织再生。因此，近年来国内外学者对血管新生促进牙周组织修复再生寄予了厚望。血管内皮细胞的增殖、迁移是血管新生的关键步骤，诱导血管新生的众多生长因子中，血管内皮生长因子（VEGF）目前被证明是促血管生成因子中活性最强、专属性最高的细胞因子。有研究表明，PHT与骨髓间充质干细胞联合应用可加速大鼠心脏缺损区血管的新生。另有实验表明，PHT在加速大鼠烧伤创面愈合过程中促进了肉芽组织的血管化和胶原沉积，并发现愈合创面中表达和活性明显增加的VEGF。因此，探索PHT在促进血管新生中的可能机制具有一定的理论和实践意义。
研究目的及意义：
观察PHT对体外培养HUVEC的增殖、迁移以及血管形成相关蛋白表达的影响，初步探究适宜浓度的PHT促进HUVEC增殖和迁移的可能机制，为未来PHT应用于牙周组织修复和再生提供一定的基础资料和实验参考。
研究方法：
1.　体外复苏、培养HUVEC，通过倒置相差显微镜、HE染色、免疫细胞化学、MTT酶标法鉴定所培养的细胞。
2.　MTT酶标法筛选出适宜HUVEC生长增殖的PHT浓度。
3.　为进一步研究VEGF/KDR通路与PHT诱导的HUVEC增殖、迁移的关系，利用SU5416抑制剂的药理学特性阻断VEGF与KDR的结合，观察适宜浓度PHT对HUVEC增殖效应的影响并通过细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察适宜浓度PHT对HUVEC迁移的影响。实验分四组，对照组：PHT药物浓度为0ug/ml，药物组：PHT药物浓度为20ug/ml，药物加抑制组：PHT药物浓度为20ug/ml及1μM的SU5416抑制剂，抑制剂组：1μM的SU5416。
4.　采用ELISA法检测PHT对HUVEC细胞VEGF分泌的影响，Western-blot法检测PHT对HUVEC中ERK，p-ERk，FAK，p-FAK蛋白表达的影响。
5.　使用SPSS19.0软件统计数据及Image　Pro　plus6.0图像分析。
结果：
1.　成功复苏HUVEC，所培养细胞形态多为卵圆形或多角形，铺路石状排列，是较为典型的内皮细胞形状和生长特点。所培养细胞Ⅷ相关抗原表达阳性，基质胶实验中形成了微血管腔样结构，进一步证实所培养的细胞为血管内皮细胞。
2.　MTT结果显示，10ug/ml~60ug/ml范围内PHT能刺激HUVEC增殖，其中20ug/ml组促进细胞的增值作用最明显，而80ug/ml组吸光度低于对照组，抑制了细胞增殖，筛选出20ug/ml的PHT作为适宜浓度用于后续实验。
3.　MTT酶标法，划痕实验和Transwell实验结果显示，与对照组相比，20ug/ml　PHT能够明显促进HUVEC的增殖，迁移，而20ug/ml　PHT联合1μM的SU5416作用48小时后，可抑制PHT诱导的HUVEC增殖和迁移效应。这提示PHT诱导的HUVEC增殖和迁移作用可能与VEGF和KDR的结合后的一系列信号传导有关。
4.　ELISA检测4组细胞上清中VEGF的结果显示，与对照组相比，20　ug/ml　PHT组VEGF分泌量明显增加，提示20ug/ml　PHT能诱导HUVEC合成释放VEGF。Western　blot结果表明各组总ERK蛋白的表达无显著性差异，p-ERK1/2、FAK和p-FAK则表现为20　ug/ml　PHT处理后蛋白表达量上调，同时这一效应受到KDR抑制剂的阻止。与对照组相比，抑制剂组p-ERK1/2的表达上调，而FAK和p-FAK表达下降。
结论：
1.　成功复苏并鉴定了HUVEC。
2.　20ug/ml　PHT能够明显促进HUVEC的增殖，迁移及VEGF的分泌，这些效应均不同程度地被20ug/ml　PHT联合KDR抑制剂作用后所抑制，这提示PHT诱导的以上效应可能与VEGF/KDR信号通路相关。20ug/ml　PHT组的p-ERK，FAK和p-FAK的表达量高于对照组，加入抑制剂后p-ERK和p-FAK两个磷酸化蛋白水平明显下降，初步证实20ug/ml　PHT对VEGF/KDR信号通路的促进作用，同时提示20ug/ml　PHT可能通过VEGF/KDR途径激活ERK1/2和FAK蛋白，从而促进HUVEC的增殖和迁移。

关　键　词：人脐静脉血管内皮细胞；苯妥英钠；血管新生；细胞增殖；细胞迁移
论文类型：应用基础