目的：
目前，困扰胰岛移植的主要问题是胰岛移植物早期丢失及远期效果不佳，这主要是由于胰岛移植物微血管破坏后血管重建困难和移植后免疫排斥反应引起的。加速胰岛移植物再血管化和抑制对胰岛移植物的免疫排斥反应就成了减少胰岛移植物早期丢失、延长胰岛移植物存活的关键。脂肪来源的间充质干细胞（adipose　derived　mesenchymal　stem　cells,　ADSCs）已被证实具有促进移植物血管重建、抑制受体对移植物免疫排斥反应的作用，并且是基因治疗的良好载体。血管内皮生长因子（vascular　endothelial　growth　factor,　VEGF）是血管内皮细胞特异性的生长因子，具有显著促进血管内皮细胞增殖及新生血管形成的功能；但是，VEGF具有在体内代谢半衰期极短（＜6　min），直接注射难以在移植局部维持有效血药浓度的缺点。本研究的目的就是通过在构建携带VEGF165基因的慢病毒载体并转染ADSCs基础上，利用ADSCs　细胞本身的促血管化作用和转染后　ADSCs稳定有效表达的VEGF165的促血管化作用及ADSCs的免疫抑制和调节作用，与胰岛体外联合培养及体内联合移植，以期促进胰岛移植物的再血管化进程，抑制对移植物免疫排斥反应，从而达到减少胰岛移植物的丢失，提高其生存率目的，并进一步探索转染VEGF165的ADSCs提高胰岛移植效果的相关机制。
方法：
1.　脂肪来源的间充质干细胞的分离、培养及鉴定：采用胶原酶消化法提取人脂肪来源的间充质干细胞，对其进行原代培养，并在传代培养过程中利用差速贴壁分离法对其纯化；利用形态学、免疫荧光检测其表面标志及向成脂、成骨诱导多向分化方法对其进行鉴定。
2.　构建表达VEGF165的慢病毒载体及转染脂肪来源的间充质干细胞：应用RT-PCR技术克隆目的基因VEGF165片段，并克隆于慢病毒骨架质粒pLVX-EF1α-IRES2-AcGFP1中，构建慢病毒主体质粒pLVX-EF1α-VEGF165-IRES2-AcGFP1，菌落PCR及测序分析鉴定目的基因VEGF165。慢病毒载体主体质粒pLVX-EF1α-VEGF165-IRES2-AcGFP1，辅助质粒gag-pro、vpr-pol、Tet-Off?、tat-IRES-rev和包膜质粒env（VSV-G）共转染Lenti-X　293T细胞，包装慢病毒载体，并进行病毒浓缩；免疫荧光法测定浓缩后的慢病毒载体滴度。浓缩的慢病毒载体转染ADSCs，测定其最佳感染指数（multiplicity　of　infection,　MOI）；免疫荧光、ELISA鉴定最佳感染指数转染状态下目的基因VEGF165在ADSCs中的体外表达情况。
3.　转染VEGF165的脂肪来源的间充质干细胞促进血管内皮细胞增殖的实验研究：采用胶原酶消化法提取人脐静脉血管内皮细胞（umbilical　vein　endothelial　cells,　UVECs），对其进行原代培养，并在传代培养过程中利用差速贴壁分离法对其纯化；利用形态学、免疫荧光技术检测其表面标志对其进行鉴定，利用流式细胞技术对其进行纯度鉴定。建立转染VEGF165的ADSCs与UVECs的共培养体系，通过流式细胞技术计数UVECs，绘制UVECs生长曲线，四甲基噻唑蓝（methylthiazol　tetraztlium,　MTT）法测定UVECs的光吸收值（OD值），比较转染VEGF165的ADSCs对UVECs增殖能力的影响；并通过ELISA法检测上清液VEGF165、肝细胞生长因子（hepatocyte　growth　factor,　HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic　fibroblast　growth　factor,　bFGF）等细胞因子浓度，利用半定量RT-PCR技术检测UVECs增殖、凋亡相关基因mRNA表达水平，进一步探讨转染VEGF165的ADSCs促进　UVECs增殖的机制。
4.　转染VEGF165的ADSCs与胰岛体外联合培养的实验研究：采用胶原酶消化法及histopaque-1077密度梯度离心法分离纯化人的胰岛，通过双硫腙染色、吖啶橙（acridin　orange,　AO）-碘化丙啶（propidium　iodide,　PI）等方法观察胰岛获得量、纯度及活性。建立转染VEGF165的ADSCs与胰岛体外联合培养体系，通过胰岛素释放实验检测胰岛刺激指数（stimulation　index,　SI），半定量RT-PCR实验检测胰岛凋亡相关基因mRNA表达水平，免疫组化酶双染法观察胰岛素、Fas、CD31的表达程度，ELISA法检测上清液VEGF165、HGF、bFGF等细胞因子浓度，评估转染VEGF165的ADSCs对胰岛的活性、功能及胰岛的UVECs包被程度的影响及机制；通过体外混合淋巴细胞培养检测淋巴细胞增值率及ELISA法检测其上清液IFN-γ、IL-2、IL-10等细胞因子浓度，评估转染VEGF165的ADSCs对淋巴细胞反应的影响及机制。
5.　转染VEGF165的ADSCs与胰岛体内联合移植的实验研究：采用链脲佐菌素（streptozotocin,　STZ）腹腔注射制备了糖尿病雄性Ba1b/c裸鼠及成年SD大鼠模型，转染VEGF165的ADSCs与胰岛联合皮下移植后，通过记录每组胰岛移植物平均存活时间（mean　survival　time,　MST）、检测血糖及胰岛素水平；于移植后7d取胰岛移植物，免疫组化酶双染法观察胰岛素、Fas、CD31、VEGF165的表达程度，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,　HE）染色观察移植物淋巴细胞浸润情况；流式细胞技术检测糖尿病大鼠外周血淋巴细胞亚群分类；ELISA法检测血清VEGF165、、IFN-γ、IL-2、IL-10等细胞因子浓度等，评估转染VEGF165的ADSCs对胰岛移植物的功能、活性、血管化、免疫排斥反应的影响及转染VEGF165的ADSCs的体内功能状况。
结果：
1.　通过胶原酶消化法及差速贴壁分离法成功获得ADSCs，获得的细胞能传20代以上，并向成脂、成骨诱导分化成功，具有干细胞特性；免疫荧光检测ADSCs的表面相关抗原见HLA-II、CD31、CD34、CD106呈阴性反应，HLA-I、CD44、CD49d、CD105呈阳性反应，符合文献报道的ADSCs表面抗原表达谱。
2.　应用RT-PCR成功克隆了目的基因VEGF165片段，构建的慢病毒主体质粒pLVX-EF1α-VEGF165-IRES2-AcGFP1经菌落PCR及测序分析比对鉴定正确；该质粒与辅助质粒gag-pro、vpr-pol、Tet-Off?、tat-IRES-rev和包膜质粒env（VSV-G）共转染Lenti-X　293T细胞获取的慢病毒载体，浓缩后滴度达1×108TU/ml；最佳MOI=20时转染ADSCs，荧光显微镜下显示ADSCs的绿色荧光表达率为96.78±3.64%，ELISA检测VEGF165浓度显示重组慢病毒载体可携带VEGF165基因在ADSCs内长期、稳定表达。
3.　通过胶原酶消化法及差速贴壁分离法成功获得UVECs，RPMI-1640完全培养基加VEGF121培养，细胞生长良好，为扁平多角形形态，呈铺路石样镶嵌排列；UVECs的CD31、vWF血管内皮细胞表面相关抗原免疫荧光检测呈阳性反应。流式细胞技术计数UVECs，绘制UVECs生长曲线及MTT法测定UVECs的OD值显示：UVECs的增殖能力于转染VEGF165的ADSCs+UVECs组高于UVECs组。ELISA法检测上清液细胞因子浓度及半定量RT-PCR技术检测UVECs增殖、凋亡相关基因mRNA表达水平显示：VEGF165、HGF、bFGF浓度于转染VEGF165的ADSCs+UVECs组高于UVECs组；促UVECs增殖的　Bcl-2、ERK1/2基因表达在转染VEGF165的ADSCs+UVECs组高于UVECs组，促UVECs凋亡的　Bax基因表达在转染VEGF165的ADSCs+UVECs组低于UVECs组。
4.　成功进行了成人胰岛的分离和纯化，胰岛获取量充足，获得的胰岛形态完整、活性及纯度高，能够满足进一步试验需要。体外联合培养时，葡萄糖刺激的胰岛素释放实验显示：随着培养时间的延长，转染VEGF165的ADSCs+胰岛组胰岛的SI无明显改变，单纯胰岛组胰岛的SI逐渐下降；半定量RT-PCR实验检测胰岛凋亡相关基因mRNA表达水平显示：促胰岛存活的　Bcl-2基因表达在转染VEGF165的ADSCs+胰岛组高于单纯胰岛组，促胰岛凋亡的Fas、Caspase-3基因表达在转染VEGF165的ADSCs+胰岛组组低于单纯胰岛组；ELISA法检测上清液VEGF165、HGF、bFGF的浓度显示：于转染VEGF165的ADSCs+胰岛组均高于单纯胰岛组；免疫组化酶双染法观察胰岛素、Fas、CD31的表达程度显示：胰岛素的表达程度及胰岛的UVECs包被程度于转染VEGF165的ADSCs+胰岛组均高于单纯胰岛组，Fas的表达程度于转染VEGF165的ADSCs+胰岛组低于单纯胰岛组；体外混合淋巴细胞培养检测淋巴细胞增值率显示：转染VEGF165的ADSCs+胰岛组的淋巴细胞增值率低于单纯胰岛组；ELISA法检测体外混合淋巴细胞培养上清液IFN-γ、IL-2、IL-10的浓度显示：转染VEGF165的ADSCs+胰岛组上清液IFN-γ、IL-2的浓度低于单纯胰岛组，IL-10的浓度高于单纯胰岛组。
5.　体内联合移植时，胰岛移植后的疗效观察显示：糖尿病裸鼠和糖尿病大鼠的血糖控制水平、胰岛素血清浓度及胰岛移植物存活时间于转染VEGF165的ADSCs+胰岛组均优于单纯胰岛组。糖尿病裸鼠胰岛移植后第7天免疫组化酶双染法观察胰岛素、Fas、CD31、VEGF165的表达程度显示：胰岛素、VEGF165的表达程度及胰岛血管化程度于转染VEGF165的ADSCs+胰岛组均高于单纯胰岛组，Fas的表达程度于转染VEGF165的ADSCs+胰岛组低于单纯胰岛组；ELISA法检测血清VEGF165的浓度显示：VEGF165的浓度于转染VEGF165的ADSCs+胰岛组高于单纯胰岛组，并在体内持续、稳定表达。糖尿病大鼠胰岛移植后第7天HE染色观察移植物淋巴细胞浸润情况显示：转染VEGF165的ADSCs+胰岛组移植物及移植物周围淋巴细胞浸润程度低于单纯胰岛组；流式细胞术外周血淋巴细胞计数显示：转染VEGF165的ADSCs+胰岛组外周血CD4+T及CD8+T细胞平均比例均低于单纯胰岛组；ELISA法检测其血清IFN-γ、IL-2、IL-10的浓度显示：转染VEGF165的ADSCs+胰岛组血清IFN-γ、IL-2的浓度低于单纯胰岛组，IL-10的浓度高于单纯胰岛组。
结论：
1.　分离纯化了脂肪来源的间充质干细胞，通过形态学、ADSCs的细胞表面抗原免疫荧光检测及向成骨细胞和成脂细胞的多向诱导分化，证实所获取细胞为间充质干细胞。
2.　成功构建了慢病毒主体质粒pLVX-EF1α-VEGF165-IRES2-AcGFP1及携带VEGF165基因的慢病毒载体；应用构建的慢病毒载体转染ADSCs，能使ADSCs长期、稳定表达VEGF165目的基因。
3.　分离纯化了脐静脉内皮细胞，通过形态学及UVECs的细胞表面抗原免疫荧光检测鉴定所获取细胞为血管内皮细胞。体外联合培养证实转染VEGF165的ADSCs具有促进UVECs增殖的作用；其促UVECs增殖的作用是通过其分泌的VEGF165、HGF及bFGF等生长因子调节UVECs内促细胞增殖及凋亡的基因表达实现的。
4.　成功分离纯化了成人胰岛。体外联合培养实验证实：转染VEGF165的ADSCs分泌的VEGF165、HGF及bFGF等生长因子能够促进内皮细胞增殖、提高胰岛移植物的内皮细胞包被；并且能够调节胰岛细胞内增殖、凋亡的基因表达，促进胰岛细胞的活性、功能，抑制胰岛细胞的凋亡。转染VEGF165的ADSCs亦能够调节体外混合淋巴细胞培养时上清液IFN-γ、IL-2、IL-10的浓度，并对淋巴细胞增殖具有抑制作用。
5.　体内联合移植实验证实：转染VEGF165的ADSCs能够通过其分泌的VEGF165等生长因子促进胰岛移植物的功能及血管化，延长胰岛移植物的存活时间；并能够通过调节糖尿病鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10的水平，减少外周血　T淋巴细胞比例，产生免疫抑制作用，从而减轻了胰岛移植物的淋巴细胞浸润破坏，使得移植物的存活获得延长。　
本研究为促进移植胰岛的血管重建、抑制对胰岛移植物的免疫排斥反应，从而提高胰岛移植治疗糖尿病的效果提供了一种安全且有效的方法，具有重要的理论价值和应用前景。