背景：
原发性肝癌在我国发病率较高，且呈现逐年增高的趋势，已经成为严重危害人们健康的社会问题。目前肝癌的治疗仍以手术切除为主，但因肝癌不易早期发现，且病程进展较快，故根治性手术切除难度较大。部分患者即使手术切除，术后复发率仍较高。因此，通过相应的研究补充并完善肝癌发生发展的机制，寻找新的治疗方案，对于改善肝癌患者的预后具有重要的意义。
近年来研究发现5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）与多种肿瘤的发生及发展密切相关，如前列腺癌、肺癌、结直肠癌、胆囊癌、肝癌等。大量的实验证据显示，5-HT对于部分肝癌细胞具有血清样作用，可以促进肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭。同时，动物实验表明5-HT可以促进移植瘤的形成及增殖，但具体的机制尚需进一步研究。因此，深入探讨5-HT对肝癌恶性生物学行为的影响及具体机制可以为今后肝癌治疗策略的制定及治疗靶点的选择提供理论支持。
Yap（yes　associated　protein）是一个公认的致癌基因，与恶性胶质瘤、肺癌、卵巢癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌等肿瘤的发生及发展相关。作为Hippo通路下游的转录共激活因子，Yap主要通过与转录调节因子相互结合，启动下游靶基因的表达发挥作用。根据Yap双色氨酸结构域（WW结构域）的数量不同，Yap可以分为Yap1及Yap2，目前的研究主要集中在Yap1。并且，关于Yap活性调节的研究主要集中于Hippo通路依赖的调节方式，非Hippo通路依赖的Yap活性调节方式的研究较少，仅发现NF2、RASSF1A等。因此，结合5-HT与Yap均与肝癌的发生发展相关的研究基础，探究5-HT是否可以通过调节Yap表达影响肝癌的进展，具有重要的临床意义。
目的：
根据5-HT水平及Yap表达量均与肝癌密切相关的研究基础，本课题旨在探讨5-HT与Yap在肝癌中的相关性及5-HT通过调节Yap表达影响肝癌恶性生物学行为的具体机制，为探索肝癌靶向治疗的新靶点提供理论基础。
方法：
1.　根据纳入排除标准，选取2013年1月至2014年6月在我院首次就诊的原发性肝癌患者，收集患者的血液及组织标本，并每3个月对患者进行随访。使用ELISA、qRT-PCR、Western　Blot检测肝癌患者及正常对照5-HT水平及Yap表达量，并对肝癌患者的5-HT水平及Yap表达量进行相关性分析。同时，通过分析临床资料，探究5-HT水平及Yap表达量与各临床特征及预后的关系。
2.　MTT、划痕实验、Transwell检测5-HT对多种肝癌细胞系的增殖、迁移及侵袭能力的影响，筛选对5-HT干预敏感的肝癌细胞系及5-HT的最佳干预浓度。Western　Blot、qRT-PCR检测5-HT对肝癌细胞Yap表达的影响。使用Yap-siRNA构建Yap低表达肝癌细胞系，通过MTT、流式周期检测、流式凋亡检测、平板克隆形成实验、Transwell、Western　Blot及qRT-PCR检测5-HT通过调节Yap表达对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。
3.　qRT-PCR检测5-HT各型受体在肝癌细胞系中的表达水平，筛选出在肝癌细胞系中表达最高的受体类型。使用5-HT2B受体抑制剂抑制5-HT2B受体的表达，然后通过MTT、流式周期检测、流式凋亡检测、平板克隆形成实验、Transwell、Western　Blot及qRT-PCR检测5-HT介导激活的5-HT2B受体对肝癌细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。同时，通过Western　Blot、qRT-PCR及免疫荧光检测激活的5-HT2B受体对Yap表达及定位的影响。
4.　通过使用AKT、ERK抑制剂及TGF-β中和抗体干预细胞，运用Western　Blot技术筛选与5-HT/Yap通路相关的经典肿瘤通路，并通过使用5-HT2B受体抑制剂、ERK抑制剂及Yap-siRNA干预细胞，运用Western　Blot技术，验证5-HT2B受体、pERK及Yap的上下游关系，得到可能的5-HT调节Yap表达的具体通路。
5.　通过使用HepG2肝癌细胞建立裸鼠皮下成瘤模型，使用5-HT2B受体抑制剂、ERK抑制剂处理动物，并于4w后处死裸鼠，称量移植瘤的大小，绘制移植瘤的生长曲线，并检测Ki-67表达和Yap的表达及定位。另外，提取移植瘤组织蛋白，并检测各蛋白表达水平，从而对细胞实验获得的通路进行验证。
结果：
1.　肝癌患者血清中的5-HT水平（P＜0.01）、血小板计数（P＜0.01）、血小板内5-HT水平（P＜0.01）、每个血小板内5-HT水平（P＜0.01）、每个血小板提取物5-HT水平（P＜0.05）、肝癌组织5-HT水平（P＜0.05）及Yap表达量（P＜0.01）均高于非肝癌患者。但是，我们也发现两组之间的血浆5-HT水平没有明显的差异。同时，肝癌患者血清5-HT水平（R2=0.1299，P＜0.0001）、组织标本5-HT水平（R2=0.1003，P=0.003）均与Yap　mRNA的表达呈正相关。高5-HT水平与PLT（P＜0.001）、肿瘤大小（P＜0.001）、死亡（P=0.007）及Yap表达（P=0.016）相关。高Yap表达与ALP（P=0.025）、GGT（P＜0.001）、AFP　（P＜0.001）、肿瘤大小（P＜0.001）、血管侵犯（P＜0.001）、死亡（P＜0.001）及5-HT水平（P=0.016）相关。另外，5-HT水平或Yap表达升高均可显著降低肝癌患者的总体生存率及无瘤生存率。
2.　HepG2及HHCC肝癌细胞对5-HT的干预最为敏感，最佳干预浓度为100μM。5-HT可以通过上调Yap及其下游CTGF表达促进肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭。但是，无抗凋亡作用。使用Yap-siRNA抑制Yap表达，可以抑制5-HT促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的能力。
3.　在HepG2及HHCC肝癌细胞中5-HT2B受体为表达水平最高的受体类型。同时，也发现5-HT可以明显促进HepG2及HHCC肝癌细胞5-HT2B受体的表达。5-HT介导激活的5-HT2B受体可以促进肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭，但同样无抗凋亡作用。另外，激活的5-HT2B受体可以促进Yap的表达及核内转运。使用5-HT2B受体抑制剂可以抑制激活的5-HT2B受体对肝癌细胞增殖及Yap表达的促进作用，并使Yap失活而定位于细胞质中，提示5-HT可以介导5-HT2B受体的激活，激活的5-HT2B受体可以通过Yap通路发挥促进肝癌的效应。
4.　给予AKT抑制剂、TGF-β1中和抗体及ERK抑制剂干预HepG2及HHCC肝癌细胞均可降低Yap表达水平，但ERK抑制剂的抑制效果最为显著。同时，5-HT可以通过激活5-HT2B受体促进pERK表达，进而促进Yap激活。使用5-HT2B受体抑制剂可以明显抑制pERK及Yap表达。使用ERK抑制剂可以显著抑制5-HT引起的Yap表达增高，并且使Yap失活而定位于细胞质中。但是，ERK抑制剂对5-HT2B受体的表达没有明显的影响。另外，使用Yap-siRNA抑制Yap表达对于5-HT2B受体及pERK表达均无明显影响，提示5-HT可以通过激活5-HT2B受体促进ERK磷酸化，最终引起Yap表达上调及核内转运，导致肝癌进展。
5.　5-HT可以促进裸鼠移植瘤体积及重量的增加，促进移植瘤Ki-67表达和Yap表达及核内转运。5-HT2B受体抑制剂及ERK抑制剂均可以抑制5-HT介导的移植瘤体积及重量的增加，抑制5-HT介导的移植瘤Yap及Ki-67表达升高，并使Yap失活而定位于细胞质中。另外，通过检测4组裸鼠移植瘤组织5-HT2B受体、pERK、总ERK及Yap表达，我们可以明确5-HT、5-HT2B受体、pERK及Yap的上下游关系。进一步证实在肝癌中，5-HT可以通过5-HT2BR/pERK/Yap通路促进肝癌的发展及转移。
结论：
1.　肝癌患者5-HT水平及Yap表达量均显著高于正常对照，5-HT水平与Yap表达量之间呈正相关。同时，高5-HT水平及高Yap表达量的肝癌患者预后不良。
2.　5-HT可以通过激活5-HT2B受体促进肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭。
3.　Yap可以促进肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭。这一过程是通过5-HT激活5-HT2B受体，上调pERK表达而促进Yap表达和激活来实现的。