研究背景：
代谢型谷氨酸受体5（mGluR5）不仅在神经元存活、生长、神经环路形成和突触可塑性中发挥重要调节作用，而且参与树突形态发生，包括树突树的分枝、数目、树突棘密度和长度。本课题组之前的研究发现，mGluR5促进了神经干细胞向神经元方向的分化，并且mGluR5在大鼠发育期表达水平显著高于成体。这些研究提示我们mGluR5是否参与了神经元极性化过程，即神经元由无极性的圆球形到生长出轴突和树突从而建立极性的过程，特别是轴突从胞体芽发这一极性建立的关键阶段。
既往研究已经鉴定了许多参与神经元极性化的细胞内外因子，如NGF、BDNF、PI3K/Akt、GSK3、RAC1和CDC42、Par极性复合物、CREB和核因子NF-κB等。在这些分子中，PI3K　/　Akt和NF-κB信号通路参与mGluR5调节的神经元发育和可塑性。更重要的是，最新研究发现，Akt和NF-κB是神经元突起生长和精细化的重要调节因子。作为PI3K信号转导的主要调节因子，Akt通过一种新的Girdin蛋白调节肌动蛋白组装和细胞运动性。而NF-κB信号通路调节轴突起始、伸长、导向和分枝的各个阶段。此外，还有研究表明，由干细胞因子（SCF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）诱导的骨髓干细胞的突起的延伸和极性化是通过激活PI3K/Akt和NF-κB信号通路而发挥作用的。因此，这些结果均提示我们探索Akt和NF-κB通路是否参与了mGluR5对神经元极性化的调节。
本研究通过分离E18.5　d　SD大鼠胎鼠海马神经元进行体外培养，给予原代培养的海马神经元mGluR5特异性拮抗剂MTEP或激动剂CHPG　处理，观察其对神经元极性化及轴突芽发的影响。基于Akt和NF-κB通路与神经元极性化的密切联系，我们观察了MTEP和CHPG处理后Akt-NF-κB的激活。并进一步探索采用Akt抑制剂LY294002阻断Akt通路后神经元极性化水平、轴突芽发及NF-κB激活的改变。从而阐释了mGluR5影响神经元极性化和轴突芽发的可能机制。
实验方法：
1.　mGluR5在培养的大鼠海马神经元中的表达以及其对神经元存活的影响
分离E18.5　d　SD大鼠胎鼠海马神经元进行体外培养，细胞接种后1　DIV（days　in　vitro）进行mGluR5免疫细胞化学染色，观察mGluR5的表达和分布。在细胞接种后48　h，分别采用RT-PCR方法和Western-blot方法观察海马神经元中mGluR5　mRNA和蛋白的表达。另外，在神经元接种后4　h，给予mGluR5特异性拮抗剂MTEP（60　μM、120　μM）或CHPG（100　μM、500　μM）处理，于给药后48　h进行MTT实验观察mGluR5对神经元活力的影响。
2.　mGluR5在神经元极性化中的作用及其对下游Akt-NF-κB信号通路的调节
神经元接种后4　h，给予原代培养的海马神经元药物处理，分组如下：（1）不同浓度的MTEP组（10　μM、30　μM、60　μM、90　μM和120　μM）；（2）不同浓度的CHPG组（100　μM、500　μM）；（3）MTEP（60　μM）和CHPG（100　μM）双加药组；（4）对照组。在给药后48　h和　60　h分别观察神经元极性化比例。并在给药后48　h测量各组神经元轴突长度、其他突起长度和数目。实验采用免疫荧光双标方法分别标记神经元的轴突（SMI312）和总突起（Tuj-1），观察神经元轴突的发育和极性化，认为当有一个突起被SMI312阳性标记，长度大于50　μm并至少是其他突起的两倍时，该神经元为极性化的神经元。用IPP软件测量突起长度和数目。并采用Western-blot方法观察mGluR5下游Akt　Ser473、p65　Ser536位点的磷酸化水平以及p65在胞浆、胞核的表达水平。
3.　抑制Akt对神经元极性化及对下游NF-κB信号通路的影响
于接种后4　h，给予原代培养的海马神经元Akt抑制剂LY294002（25　μM）处理，在给药后48　h观察神经元极性化比例和轴突芽发。并采用Western-blot方法检测Akt下游NF-κB通路p65　亚基Ser536位点的磷酸化水平以及p65在胞浆、胞核的表达水平。
实验结果：
1.　在Neurobasal培养基+B27　supplement+GlutaMax的无血清培养基中培养E18.5　d胚胎大鼠海马神经元，神经元生长状况良好、存活率高，接种7　DIV后纯度＞95%，适合进行细胞形态学观察。海马神经元在接种后48　h，其中一个突起快速延伸成为轴突，并且可以被SMI312阳性标记，是观察极性化的最佳阶段。
2.　mGluR5表达于新生海马神经元（1　DIV）的胞体和突起中，并且在2　DIV海马神经元中有mGluR5的mRNA和蛋白表达。
3.　大鼠海马神经元接种后4　h，给予mGluR5激动剂CHPG或者拮抗剂MTEP处理并不影响神经元的存活。
4.　于接种后4　h给予原代培养的大鼠海马神经元高浓度的MTEP（60　μM、90　μM和120　μM）处理，显著抑制了神经元的极性化和轴突芽发，表现为极性化的细胞数目占总细胞数目比例显著下降，轴突长度变短，而其他突起长度和突起数目不变。
5.　于接种后4　h给予原代培养的海马神经元高浓度的MTEP（60　μM、90　μM和120　μM）处理，显著降低了神经元p-Akt、p-p65的表达以及p65的转位入核。
6.　细胞接种后4　h给予25　μM　LY294002处理显著抑制了海马神经元的极性化和轴突芽发，表现为极性化细胞数目占总细胞数目比例显著下降，轴突长度变短，其他突起长度和突起数目不变。
7.　LY294002给药显著降低了原代培养的神经元p-p65的表达以及p65的转位入核。
8.　细胞接种后4　h给予mGluR5激动剂CHPG处理并不影响神经元极性化水平，表现为在给药后48　h和60　h，极性化神经元的比例和轴突长度与对照组相比没有差异。
9.　细胞接种后4　h给予mGluR5激动剂CHPG处理，NF-κB亚基p-p65的表达水平和p65的核转位水平与对照组相比均无显著性变化。
实验结论：
1.　mGluR5表达于原代培养的大鼠海马神经元的胞体和突起。
2.　MTEP处理阻碍了原代培养的大鼠海马神经元极性化和轴突芽发，并下调其下游Akt和NF-κB通路的激活。
3.　由于Akt抑制剂LY294002也抑制了原代培养的大鼠海马神经元极性化和轴突芽发，并下调了NF-κB通路的激活，因此，我们认为，Akt-NF-κB可能参与了mGluR5对神经元极性化的调节作用。