目的：
肾缺血再灌注损伤　(ischemia　reperfusion　injury，IRI)与急性肾损伤、移植肾功能延迟恢复、急慢性排斥和慢性肾脏病、移植肾肾病等疾病的发病密切相关，仍缺乏有效的干预措施。DNA甲基化是基因表观修饰方式之一，参与基因表达调控，与IgA肾病、慢性肾脏病的纤维化进展、糖尿病肾病等关系密切。但是肾IRI与DNA甲基化的关系、抑制DNA甲基化对肾IRI的影响、肾IRI过程中DNA甲基化的模式及筛选差异甲基化基因等未见报道，本研究首次探讨DNA甲基化在肾IRI中的作用及机制，为相关疾病诊断、治疗及预后判断提供新方向或新措施，减低相关疾病的发病率和病死率。
方法：
1.　雄性C57BL/6小鼠行肾IRI模型，24h和7d后获取肾脏，矢状面剖开分别用于H&E染色（检测病理变化，确定模型成功）和PCR（检测肾脏甲基化相关酶表达变化）；不同剂量的DNA甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine,　DAC）处理近端肾小管上皮细胞系HK-2，MTT法检测细胞活力；再用正常、低剂量DAC预处理C57BL/6小鼠3d，其后行肾IRI模型，继续干预，共6d，造模后2d和5d生化分析仪检测肾功能，观察肾功变化。PCNA免疫荧光分析肾小管细胞增殖；H&E染色判断肾组织病理学变化、Tunel染色检测肾小管上皮细胞凋亡、免疫组织化学检测炎细胞浸润、流式细胞仪分析肾组织调节性T细胞（Treg）表达变化及巨噬细胞表型特征；CD25单抗清除小鼠体内Treg，进一步明确DAC作用机制。
2.　雄性C57BL/6小鼠肾IRI造模后24h和7d获取肾组织，矢状面剖开，一半用于H&E染色判断肾组织病理学变化，确保模型成功；另一半肾组织经DNA提取、酶切、重亚硫酸盐转化、PCR扩增等构建测序文库后测序，即应用简化代表性重亚硫酸盐测序技术（reduced　representation　bisulfite　sequencing,　RRBS）检测正常肾组织、肾IRI后24h和7d肾组织全基因组甲基化差异，筛选不同甲基化基因，用焦磷酸测序及PCR选择性的进行甲基化验证及分析与基因表达的关系。
3.　应用免疫组织化学、激光共聚焦检测雄性C57BL/6小鼠肾IRI后甲基化修饰Ccr9基因在正常及IRI肾脏的表达和定位研究；同时用PCR、免疫组化检测CCR9配体CCL25表达变化；体外脂多糖（LPS）刺激HK-2细胞，模拟炎症环境，观察CCR9表达变化；最后用CCL25抗体拮抗IRI肾模型中CCR9/CCL25相互作用，生化分析仪检测肾功、H&E染色检测病理变化、Tunel染色检测肾小管上皮细胞凋亡、免疫组化分析肾小管上皮细胞的增殖，PCR分析肾脏促炎因子的变化，分析拮抗CCR9/CCL25通路的相互作用对肾IRI的作用和机理。
结果：
1.　与假手术组比较，肾IRI后24h甲基化转移酶Dnmt3b表达增加，去甲基化酶Tet1和Tet1表达降低，7d后又恢复至正常水平。较高剂量DAC影响HK-2细胞活力、增殖，小于250nM未见明显影响。常规剂量及低剂量DAC在IRI后2d肾功均明显改善，但5d时常规剂量组肾功无进一步改善，PCNA染色提示其明显影响肾小管上皮细胞增殖，而低剂量组则无明显影响。低剂量的DAC对肾IRI具有保护作用，可以改善肾功、病理损伤，减低肾小管上皮细胞凋亡，抑制肾组织炎细胞浸润，增加肾组织Treg表达，促进巨噬细胞向抑制免疫反应的M2型转化，CD25单抗减低了低剂量DAC的肾IRI保护作用。
2.　肾IRI后24h和7d全基因组甲基化测序的各组总体CpG10数据（测序覆盖度≥10的数据）及每组基因不同区域CpG10数据比较，无明显的差异，每组2个样本间甲基化水平均具有很高的相关性，提示测序数据可靠、一致性好。与假手术组比较，肾IRI后24h和7d的总CpG甲基化、启动子区CpG甲基化、CpG岛甲基化、外显子、内含子甲基化水平均明显减低；且分别有200个、191个基因表现出启动子区甲基化状态（differentially　methylated　promoter,　DMPs）改变。24h后DMPs基因的GO功能聚类分析提示与细胞代谢、微管定位、线粒体功能、细胞骨架依赖的胞内转运、氧化还原等过程相关。应用焦磷酸测序确认了肾IRI中五个基因2700049A03Rik、Ccr9、Fgd2、Pfkfb3和Sdc4启动子存在甲基化改变。实时荧光定量PCR发现基因2700049A03Rik启动子甲基化与其在IRI肾脏中表达呈明显的负相关。
3.　基因Ccr9在正常及IRI肾脏均有表达，包括肾小球、肾小管，且肾IRI后表达增加，激光共聚焦显微镜检查确认其与肾小管上皮细胞共定位，其配体CCL25在肾IRI后明显表达；体外脂多糖模拟的炎症环境刺激HK-2细胞可以进一步增加CCR9表达，肾IRI小鼠模型的抗CCL25治疗，可以改善肾功能、减低病理损伤，同时也减低炎症反应及肾小管上皮细胞凋亡，还可促进肾小管上皮细胞的增殖，对肾IRI具有保护作用。
结论：
1.　DNA甲基化参与肾IRI过程，低剂量DNA甲基转移酶抑制剂（DAC）具有肾IRI保护作用，其机制与增加肾组织Treg表达、促进巨噬细胞向M2型转化相关；
2.　肾IRI下调了全基因组范围内总体甲基化水平，基因启动子表现出不同的甲基化模式，基因启动子的甲基化修饰调整了肾IRI基因的表达；
3.　CCR9/CCL25途径参与肾IRI病变过程，抗CCL25治疗可以减低肾IRI炎症反应，对肾IRI有保护作用。