Abstract:
癫痫持续状态(Status epilepticus, SE)发作会导致海马齿状回(Dentate gyrus, DG)异常神经发生,包括神经前体细胞增殖活动增强和新生颗粒细胞的异常整合:门区颗粒细胞异位迁移(Ectopic granule cells, EGCs),苔藓纤维出芽(Mossy fibre sprouting,MFS)以及门区底树突(Hilar basal dendrites, HBDs)的形成。然而,海马异常神经发生对颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy, TLE)慢性期自发反复癫痫发作(Spontaneous recurrent seizures, SRSs)的影响仍然存在争议。通过抑制颞叶癫痫早期齿状回神经发生观察其对疾病慢性期癫痫自发发作的影响,以前的研究产生了相反的结论。我们认为至少有两个重要因素导致了上述现象。首先,以前的研究忽略了SE之前产生的新生颗粒细胞。有文献报道,SE之前海马新生颗粒细胞会受到癫痫发作的影响而形成异常整合。所以,仅仅抑制SE以后新生颗粒细胞不能更为有效地减轻异常神经整合。其次,没有考虑新生颗粒细胞的异常整合需要较长的时间才能充分形成。SE以后较短时间内行为学观察并不能客观评价抑制海马神经发生对SRSs的影响。为了进一步明确海马异常神经发生对SRSs的影响,本实验采用匹鲁卡品诱导小鼠颞叶癫痫的模型,使用DNA甲基化的试剂,醋酸甲基氧化偶氮甲醇(Methylazoxymethanol acetate, MAM)抑制SE前以及SE后齿状回的新生细胞,并且在SE以后10-12周监测SRSs。
实验目的
1. 进一步证实SE之前新生的颗粒细胞参与形成颞叶癫痫慢性期异常神经整合。
2. 阐明海马异常神经发生对匹鲁卡品癫痫小鼠慢性期发作的影响。
实验方法
1. 匹鲁卡品诱导:25-30g雄性昆明小鼠皮下注射东莨菪碱(1mg/kg),30分钟后,腹腔注射匹鲁卡品(300mg/kg)。大多数动物可进入癫痫持续状态。
2. 立体定位注射携带绿色荧光蛋白的逆转录病毒(Retroviral vectors expressing GFP, RV-GFP):将RV-GFP(3×109CFU/ml)注射到双侧海马齿状回。坐标为:前囟后1.58mm、2.7mm,旁开1.0mm、2.0mm,深度1.80mm、1.75mm。0.5μl/点/10分钟。
3. MAM 注射:MAM按5mg/kg,间隔48小时,持续8周。期间监测动物的体重变化及其它一般健康状况。
4. BrdU标记:在MAM注射8周以后,于处死前的2小时,按150mg/kg腹腔注射BrdU。
5. 视频检测SRSs:SE以后10周,动物接受24小时/天、为期14天的视频监测。监测内容包括SRSs次数,5级发作次数,发作持续时间。
6. Fluoro Jade B(FJB)、Nissl染色用于检测MAM可能对SE的影响及神经元损伤;BrdU,Ki67和DCX免疫组织化学染色用于观察齿状回神经细胞增殖;BrdU和NeuN免疫荧光双标染色用于标记异常迁移的新生神经元;Timm染色用于检测MAM对慢性期海马苔藓纤维出芽的影响。
7. 数据采集与分析:所有数据以均数 ± 标准差表示,应用GraphPad Prism 5.0进行数据分析。使用独立样本t检验比较细胞计数以及MAM实验组和生理盐水组之间动物体重的变化。P﹤0.05 为差异具有统计学意义。
实验结果
1. 匹鲁卡品诱导后的行为学改变:在注射匹鲁卡品以后,小鼠出现一系列行为学的变化,包括活动减弱,颤抖,点头,四肢抽搐,全身痉挛的癫痫持续状态表现。
2. SE之前1-4周齿状回新生神经元参与形成异常整合:SE之前1-4周标记RV-GFP,SE4周后可见门区异位GFP阳性细胞和底树突形成。齿状回内分子层可见颗粒状GFP阳性染色,表明轴突芽发的形成。
3. MAM能够有效抑制齿状回神经发生:在注射MAM 8周后,和生理盐水组比较,MAM实验组齿状颗粒细胞下层(subgranular zone, SGZ)BrdU免疫阳性细胞数明显减少。
4. MAM注射不影响海马神经元损伤、持续状态发作和癫痫慢性期海马神经发生:FJB染色的结果显示,MAM实验组和生理盐水组海马CA1,CA3和门区FJB阳性细胞无明显差异;两组动物诱导潜伏期、5级发作的次数以及SE的持续时间均无显著差异;SE后10周,MAM实验组和生理盐水组动物齿状回DCX免疫阳性细胞数量无显著差异。
5. MAM注射减少了SE后10周齿状回的异常神经整合:MAM实验组齿状回门区BrdU+NeuN双标免疫阳性细胞数量较生理盐水组明显减少;MAM实验组齿状回内分子层(Inner molecular layer, IML)Timm染色评分较生理盐水组明显下降。
6. MAM注射未能有效减轻SRSs:SE后10周,MAM实验组和生理盐水组SRSs发作频次、5级发作次数和每次发作持续时间均无显著差异。
结论
1. SE之前新生颗粒细胞参与形成异常整合。
2. 匹鲁卡品诱导的小鼠颞叶癫痫模型中,海马异常神经发生在SRSs中可能并不起关键作用。
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Degree: 医学硕士
Mentor: 刘建新
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Year: 2017
Language: Chinese
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