背景：
青光眼（glaucoma）是一组以导致视网膜节细胞（retinal　ganglion　cells，RGCs）及视神经（optic　nerve，ON）不可逆性损伤为主的神经系统退行性病变，是全球范围内第二大致盲眼病，其发病机制至今尚未阐明。大量证据表明视神经乳头（optic　nerve　head，ONH）作为视网膜节细胞轴突汇聚并形成视神经的关键部位，在青光眼发病中扮演重要的角色。一些青光眼特征性的病理改变发生在视乳头。视乳头星形胶质细胞是白质星形胶质细胞亚型之一，其作为分布在视乳头处的最为常见的胶质细胞类型之一，它对维持神经细胞的生理功能极为重要。并且近年来研究发现，在多种视神经损伤模型中星形胶质细胞均产生强烈应答反应。
目的：
星形胶质细胞在视乳头形成胶质板，其轴突和胞体交错重叠构成孔洞包裹节细胞无髓鞘轴突形成纤维束。在青光眼早期视乳头星形胶质细胞发生活化。本课题旨在研究视乳头处星形胶质细胞在慢性高眼压小鼠模型中的活化表型，旨在阐明视乳头星形胶质细胞对慢性高眼压性视神经损伤是否具有特异性应答改变。同时研究年龄因素对慢性高眼压性损伤引起的视乳头星形胶质细胞是否具有影响作用。从而为进一步阐明原发性青光眼发病机制提供理论依据。
方法：
1.　本实验采用B6.hGFAPpr-GFP转基因小鼠，该种系小鼠在中枢神经系统以及视神经中具有表达绿色荧光蛋白（green　fluorescent　protein,　GFP）的星形胶质细胞。该品系小鼠的使用可以帮助我们更加准确细致的观察到单独的活化的星形胶质细胞个体是如何发生形态变化的，以及细胞的三维空间结构，与周围细胞及组织关系如何。为去除母代基因背景中rd1突变体，我们从hGFAPpr-GFP小鼠每一代选取一个纯合子与C57BL/6回交，并选用杂合子后代作为研究对象。分组前，所有实验动物均进行眼底照相和OCT检查，以确保所有实验动物均无眼底结构异常。
2.　利用聚苯乙烯微球前房注射法建立B6.hGFAPpr-GFP小鼠慢性高眼压模型，分为高眼压组（高龄组6-8个月、低龄组2-3个月），对侧眼对照组（高龄组6-8个月、低龄组2-3个月），空白对照组（高龄组8-9个月、低龄组2-3个月），假手术组（2-3个月）；所有入组小鼠均测量基础眼压，接受手术处理的小鼠术后28d每隔3-4d监测眼压。28d后检测各组视网膜节细胞及视神经损伤情况。
3.　对每个ONH组织进行分区，从前部巩膜环水平向后分为4个区，每个区域厚度100µm，分别为区域1、区域2、区域3、区域4。距离巩膜环400µm以后的组织不作为分析对象，以确保纳入实验分析的星形胶质细胞来自于ONH无髓鞘视神经区域。利用共聚焦显微镜（confocal　microscopy）对每一组视乳头4个区域的星形胶质细胞进行形态学观察并进行三维立体图像重建。
4.　为了量化分析视乳头不同区域活化星形胶质细胞的形态改变，采用ImageJ　（National　Institute　of　Health,　USA）图像分析软件对视乳头组织共焦图像进行分析，并采用单一神经突起追踪插件（simple　neurite　tracer　plugin）测量个体星形胶质细胞的所有突起长度并进行统计学比较。对比视乳头不同区域星形胶质细胞的突起变化。分析星形胶质细胞活化与视网膜节细胞损伤程度的相关性。
5.　对经过共聚焦显微镜检测的具有活化星形胶质细胞的视乳头组织进行二次固定、切片，并进一步采用透射试电子显微镜（transmission　electron　microscopy，TEM）进行图像采集。检测视乳头组织细胞内部结构及活化星形胶质细胞与周围组织结构的关系。
6.　采用相同方法对对低龄（2-3个月）高眼压组视乳头活化星形胶质细胞进行形态分析，对比低龄高眼压组及空白对照组视乳头与高龄高眼压组及空白对照组视乳头的电镜下结构，初步探讨随年龄变化正常小鼠视乳头结构的变化，以及年龄因素在高眼压性视神经损伤引起的视乳头星形胶质细胞活化的影响。
结果：
1.　前房聚苯乙烯微球注射可成功在B6.hGFAPpr-GFP小鼠种系建立慢性高眼压模型。单次注射可使眼压较基础水平升高最高约10mmHg，并持续4w。其累积眼压（cumulative　intraocular　pressure，cIOP）以及最大眼压（maximum　intraocular　pressure，mIOP）较对侧眼对照组显著升高。
2.　慢性高眼压可引起B6.hGFAPpr-GFP小鼠视网膜节细胞及视神经损伤。眼底照相和OCT检查显示前房微球注射后4w视网膜无明显的视网膜神经纤维层缺失，视网膜厚度无显著改变。视网膜铺片的RGCs免疫荧光染色及计数显示，微球注射组RGCs密度显著低于年龄匹配空白对照组。视神经PPD染色及视神经损伤评级显示微球注射组中等程度的视神经损伤。
3.　在B6.hGFAPpr-GFP小鼠种系一侧眼进行前房微球注射可引起对侧眼平均眼压较眼压基准值有所升高，但不会引起对侧眼视网膜节细胞及视神经损伤。假手术组前房注射生理盐水后没有观察到眼压升高，无视网膜节细胞损伤，PPD染色未见视神经损伤。
4.　慢性高眼压可引起视乳头星形胶质细胞发生特异性活化改变。对ONH进行共聚焦显微镜检测显示活化星形胶质细胞新生平行于视神经纤维走行的纵行突起。且分布越接近髓鞘移行区（myeline　transition　zone，MTZ）的星形胶质细胞越容易新生纵行突起。相关性分析结果显示视网膜节细胞损伤的程度越重，活化的星形胶质细胞发出的纵行突起数量越多。性别对星形胶质细胞新生纵行突起无显著影响。
5.　视乳头组织电镜下结构。慢性高眼压组视乳头活化的星形胶质细胞新生纵行突起深入无髓视神经轴突纤维束之间，纵行突起内部包含退化线粒体。除此之外，与年龄匹配的正常空白对照组相比，高眼压组ONH区域出现形状和大小不同的空泡样结构；视神经轴突之间的间隙增宽，星形胶质细胞发出细小突起深入疏松的轴突间隙，包绕个别轴突。
6.　慢性高眼压可引起低龄（2-3个月）B6.hGFAPpr-GFP小鼠视乳头星形胶质细胞活化产生纵行突起。共聚焦显微镜下可观察到低龄高眼压组视乳头近髓鞘移行区星形胶质细胞新生纵行突起。低龄微球注射组视乳头星形胶质细胞L/T比值显著高于同龄空白对照组。
结论：
1.　前房聚苯乙烯微球注射可成功在B6.hGFAPpr-GFP小鼠种系建立慢性高眼压模型。B6.hGFAPpr-GFP小鼠种系单侧眼微球注射不会引起对侧眼视网膜节细胞损伤及胶质活化。
2.　慢性眼压升高可引起视乳头近髓鞘移行区（MTZ）星形胶质细胞活化新生平行于视神经纤维走行的纵行突起。星形胶质细胞的纵行突起是高眼压性视神经损伤早期的特征性改变，与视网膜节细胞丢失程度相关。星形胶质细胞新生纵行突起内部包含退化线粒体。
3.　年龄因素对高眼压性视神经损伤相关的星形胶质细胞特异性纵行突起形成的影响不大。
4.　首次采用二次制备方法对同一微小组织块进行区域选择性电镜检测，大大提高目标组织检测效率，在实验方法上具有创新性。