摘　　要
研究背景：
神经干细胞（neural　stem　cells,　NSCs）作为一类多潜能性干细胞，终生存在于成年哺乳动物脑内的一些特定区域，如侧脑室的室下区（subventricular　zone,　SVZ）和海马齿状回颗粒下区（subgranular　zone,　SGZ）。脑缺血损伤后，NSCs可迁移到损伤区，参与脑损伤修复。这些发现为我们提供了一种全新的治疗策略，即通过移植或者激活自体NSCs，使其迁移到损伤区并最终分化为功能性神经元，从而达到治疗目的，这使得治愈脑卒中在内的多种中枢神经系统疾病成为可能。当前NSCs应用研究的关键点在于诱导其增殖、保持其在脑内的存活，并引导其迁移和定向分化为目标细胞。脑内微环境中各种信号分子的变化决定着NSCs增殖、存活和分化方向。这些信号分子包括缺氧信号、神经营养因子及神经递质和microRNA等。
MicroRNA是一类短的内源非编码RNA，由大约20～22个核苷酸组成，它通过与靶基因mRNA的3’非编码区的结合位点结合，参与基因转录后调控。在机体发育的不同阶段、不同组织中microRNAs的表达水平存在显著差异，即microRNAs的表达具有很强的时序性和位相性。近年来研究证实miR-21参与调节脂肪间充质干细胞、人乳腺癌细胞在内的多种类型细胞增殖和分化，但其在调节神经干细胞/前体细胞（NSPCs）作用和机制知之甚少。因此，本研究已miR-21为切入点，重点研究了其对神经干细胞/前体细胞（NSPCs）增殖和分化的调节作用和可能的作用机制。补充并完善内源性神经发生的机制，进而为中枢神经系统损伤修复治疗提供一定的基础理论和指导。
研究目的：
1.　观察miR-21对培养大鼠神经干细胞/前体细胞增殖和分化的影响。
2.　探讨miR-21影响神经干细胞增殖和分化的胞内信号转导机制。
研究方法：
1.　离体培养孕14至16天大鼠胚胎NSPCs。
2.　在无血清的完全培养基和自然分化培养基培养NSPCs，分别培养7天，每天提取细胞总RNA，qRT-PCR检测不同培养基中miR-21表达的变化。
3.　设计购买pre-miR-21和anti-miR-21片段，无意义序列作为对照。随机将细胞分为阴性对照组、敲除miR-21组和高表达miR-21组，应用Lipofectamine　2000　NSPCs分别转染pre-miR-21、anti-miR-21或者无意义序列。
4.实验将对不同组间均进行MTT、qRT-PCR、免疫荧光染色、Westen印记实验项目，每项实验转染时都使用3×2的六孔板3个，每个六孔板分别标记A组两孔为阴性对照组，B组两孔为高表达组pre-miR-21组，C组两孔为miR-21　anti-miR-21组。
5.　MiR-21对NSPCs分化影响：完全培养基贴壁培养NSPCs三天，免疫组化检测统计未成熟神经元标记物Tuj1和PSC-NCAM。
6.　MiR-21对NSPCs增殖影响：完全培养基培养NSPCs，应用MTT方法，分别在培养2小时、6小时、12小时、24小时和48小时检测不同处理组细胞活力；培养细胞三天，掺入BrdU免疫组化检测统计BrdU阳性细胞；同样培养细胞三天Western　blotting检测细胞周期蛋白Cyclin　D1。
7.　MiR-21影响胞内信号转导机制：完全培养基培养NSPCs三天，Western　blotting检测AKT和GSK-3β磷酸化水平。
研究结果：
1.　MiR-21参与调节NSPCs增殖和分化
qRT-PCR结果显示与完全培养基相比，分化培养基中miR-21表达显著升高并且出现时间依赖性。
2.　MiR-21对NSPCs分化的影响
PSA-NCAM和Tuj1结果显示，与无意义序列对照组相比，过表达miR-21后PSA-NCAM和Tuj1阳性细胞数显著升高，而干扰miR-21后PSA-NCAM和Tuj1阳性细胞数则降低。
3.　MiR-21对NSPCs增殖的影响
MTT结果显示，过表达miR-21细胞活力降低而干扰miR-21后细胞活力则显著升高。BrdU统计显示过表达miR-21后BrdU阳性细胞数则显著降低，而干扰miR-21后BrdU阳性细胞数显著升高。Cyclin　D1结果同BrdU结果相似，过表达miR-21后Cyclin　D1表达抑制，干扰miR-21则Cyclin　D1表达则升高。
4.　MiR-21对AKT和GSK-3β信号通路的影响
Western　blotting结果显示过表达miR-21后AKT磷酸水平降低，GSK-3β磷酸水平升高，而干扰miR-21后则结果相反。
研究结论：
1.　MiR-21参与调控培养的大鼠NSPCs增殖和分化。
2.　MiR-21促进培养的大鼠NSPCs向神经元方向分化。
3.　MiR-21抑制培养的大鼠NSPCs增殖。
4.　MiR-21通过调节AKT和GSK-3β通路活性影响NSPCs增殖和分化。