研究背景：
肺动脉高压（Pulmonary　hypertension,　PH）是由多种因素引起的肺血管功能及结构性异常，导致肺血管阻力增加，引起肺动脉压力持续升高的临床综合征，严重时可导致右心室功能衰竭甚至死亡。肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary　artery　smooth　muscle　cells,　PASMCs）的异常增殖在PH发病过程中起着关键性作用。鞘脂类（Sphingolipids）参与调节细胞的多种病理生理变化，鞘氨醇(Sphingosine)在鞘脂类代谢中起着非常重要的作用，鞘氨醇可在神经鞘氨醇激酶1（Sphingosine　Kinase-1,　SphK1）的催化下特异性的产生1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate,　S1P），S1P以自分泌及旁分泌的方式抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。研究发现SphK1/S1P信号通路参与肺动脉高压的发生。转化生长因子（transforming　growth　factor-β,　TGF-β）超家族作为促生长因子被证实参与肺动脉高压的发生。但SphK1/S1P信号通路是否介导TGF-β1诱导的PASMCs增殖及其可能的分子机制仍不清楚。
研究目的：
明确SphK1/S1P信号通路是否参与TGF-β1诱导的PASMCs增殖及其具体作用机制，为治疗PH寻求新靶点。
研究方法：
1.　选取体重80~100g的SD大鼠，采用组织块贴壁法培养PASMCs，应用α-SM-actin免疫荧光法鉴定细胞纯度；
2.　采用Western　blot技术探索TGF-β1在不同浓度(1、3、10、30ng/ml)和不同作用时间(12、24、48、72h)条件下对SphK1蛋白表达的影响，确定TGF-β1作用的最佳浓度和时间；
3.　将PASMCs分为对照、TGF-β1、SB431542+TGF-β1三组，用Western　blot检测各组细胞p/t-Smad2/3、SphK1蛋白表达水平；用Elisa法测定细胞内和其培养基中S1P的含量；
4.　将PASMCs　分为对照、TGF-β1、Control　siRNA+TGF-β1、SphK1　siRNA+TGF-β1四组，用Western　blot　检测各组细胞NICD3蛋白表达水平；
5.　将PASMCs　分为对照、TGF-β1、SB431542+TGF-β1、Control　siRNA+TGF-β1、SphK1　siRNA+TGF-β1、DAPT+TGF-β1六组，采用MTT法评价细胞增殖情况；
研究结果：
1.　PASMCs的培养及鉴定
细胞呈多边形或梭形，部分融合时呈现出典型的“峰-谷”样生长。应用α-SM-actin细胞免疫荧光染色后，高倍镜下可见胞浆内大量与细胞长轴平行排列的绿色纤维细丝，鉴定为PASMCs，其纯度＞　90%。
2.　TGF-β1促进PASMCs中SphK1表达
在PASMCs中，TGF-β1可促进SphK1表达，在浓度为10ng/ml时作用最为显著(P＜0.05，与对照组比较)；在不同时间条件下TGF-β1对SphK1表达的促进作用在第24h最为显著(P＜0.05，与对照组比较)；
3.　TGF-β1通过Smad2/3促进SphK1表达和S1P合成
在PASMCs中，TGF-β1可明显上调SphK1的表达和S1P合成（P＜0.05，与对照组相比），而预先给予SB431542抑制Smad2/3磷酸化后，TGF-β1诱导的SphK1高表达和S1P合成被逆转，SphK1蛋白水平由1.95倍降至1.39倍（P＜0.05，与TGF-β1组相比），胞内S1P水平由1.76倍降至1.35倍（P＜0.05，与TGF-β1组相比），细胞培养基中S1P水平由1.59倍降至1.24倍（P＜0.05，与TGF-β1组相比）；
4.　TGF-β1通过SphK1/　S1P促进Notch3活化
TGF-β1可以明显促进PASMCs中Notch3受体活化，使NICD3蛋白裂解增加（P＜0.05，与对照组相比），而预先沉默SphK1后TGF-β1诱导的Notch3活化被逆转，NICD3蛋白水平由1.40倍降至1.02倍（P＜0.05，与TGF-β1组相比）；
5.　TGF-β1促进PASMCs增殖的分子机制
TGF-β1可明显促进PASMCs增殖，其增殖率为对照组的1.67倍（P＜　0.05，与对照组相比），而预先给予SB431542干预Smad2/3磷酸化或SphK1　siRNA预转染或DAPT抑制Notch3受体活化后，PASMCs的增殖均被部分逆转，其增殖率分别下降至对照组的1.27倍、0.97倍和1.39倍（P＜　0.05，与TGF-β1干预组相比）。
结论：
TGF-β1通过促进Smad2/3磷酸化进而上调SphK1的表达，促进S1P的合成及分泌，继而促进Notch3的激活，最终促进PASMCs增殖。本研究阐明了Sphk1/S1P介导TGF-β1诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制，为新的靶向药物的研发提供了思路。