目的：
结直肠癌（colorectal　cancer,　CRC）是全世界癌症相关死亡的主要疾病之一，以化疗为主的新辅助疗法极大提高了CRC患者的生存率，但进展期CRC患者中仅有10-15%对标准化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）敏感，且伴有严重的毒副作用，化疗失败成为结直肠癌复发和预后不佳的主要原因。有研究表明肠道菌群在化疗药物抗肿瘤过程中发挥重要作用。本研究拟通过构建小鼠结肠癌模型和高通量测序等方法比较5-FU、益生菌或混合抗生素处理组小鼠肿瘤大小并分析小鼠肠道菌群结构特征，来探讨小鼠肠道菌群与结肠癌5-FU化疗间的关系。
方法：
1.　小鼠皮下结肠癌模型的构建及分组。BALB/c小鼠皮下注射CT26细胞，构建小鼠皮下结肠癌模型。建模成功小鼠分至四组，每组8只：1）Control组：腹腔注射生理盐水+灌胃去离子水；2）FU组：腹腔注射5-FU+灌胃去离子水；3）FU.ABX组：腹腔注射5-FU+ABX（万古霉素、氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑）饮水；4）FU.Probiotics组：腹腔注射5-FU+灌胃益生菌。动态观察33天中小鼠体重及肿瘤体积变化情况，观察小鼠的基本情况，收集小鼠粪便、肠内容物及外周血等样本。
2.　采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase　chain　reaction-denaturing　gradient　gel　electrophoresis,　PCR-DGGE）技术分析四组小鼠粪便和肠内容物细菌基因组16S　RNA　V3区扩增产物，比较菌群的丰度和多样性等；对优势和差异性条带切胶测序分析，发现各组小鼠的优势菌和差异菌；应用实时定量PCR　(real-time　quantitative　PCR,　qPCR)技术检测几种重要细菌在各组小鼠粪便中的拷贝数。
3.　利用高通量测序技术分析四组小鼠的肠道菌群特征，分析菌群结构的差异。利用PICRUSt软件和KEGG数据库对16S　rRNA测序数据进行功能预测，分析各组肠道菌群功能相关基因的差异。
4.　HE染色观察小肠粘膜完整性；ELISA法检测小鼠血清细胞因子IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达；反转录实时定量PCR　(reverse　transcription-qPCR,　RT-qPCR)　技术定量分析小鼠肿瘤组织中促肿瘤增殖相关基因VEGFA、抑制凋亡基因BCL-2、促凋亡基因BAX和Caspase-3的mRNAs表达水平，比较各组间的差异表达。
结果：
1.　成功建立了小鼠皮下结肠癌模型；FU组小鼠肿瘤体积显著小于对照组（P＜0.001）；FU.ABX组小鼠肿瘤体积大于FU组（P＜0.001）；FU.Probiotics组肿瘤体积与FU组无显著差异（P＞0.05）。各组小鼠体重无显著差异。FU.ABX组出现严重的小鼠毛发变暗、稀疏、杂乱，精神不振和运动减少情况。四组小鼠发生腹泻数分别为：0、3、7、0。　
2.　小鼠粪便和肠内容物样本PCR-DGGE结果显示，相对于FU组，FU.ABX组样本的条带数目和Shannon多样性指数均显著降低；相似性分析显示四组间有显著差异；肠内容物与粪便样本的PCR-DGGE分析结果相似。qPCR定量结果：相对于Control组，FU组小鼠肠道普通拟杆菌含量增高，乳酸杆菌属和双歧杆菌属拷贝数降低；与FU组比较，FU.ABX组小鼠肠道普通拟杆菌、脱硫弧菌属、梭菌属、普氏菌属、乳酸杆菌属和双歧杆菌属拷贝数降低，而肠杆菌科细菌数量显著增高；相较于FU组，FU.Probiotics组小鼠肠道普氏菌属丰度增高，普通拟杆菌含量降低。
3.　高通量测序结果显示，与Control组比较，FU组肠道菌群α-多样性降低；与FU组比较，FU.ABX组肠道菌群丰度和多样性均显著降低；Beta多样性分析（PCA、NMDS等）显示四组菌群结构差异显著。相对于Control组，FU组中放线菌门降低，Lachnospiracea_NK4A136、Bacteroides、Odoribacter、Mucispirillum和Blautia丰度增高，动物乳杆菌（Lactobacillus_animalis）和肝螺杆菌（Helicobacter_hepaticus）丰度减少；与FU组比较，FU.ABX组变形菌门显著增加，肠杆菌属、大肠志贺氏杆菌属（Escherichia　shigella）和柔嫩梭菌（Clostridium_leptum）显著增加，其它绝大多数细菌减少；FU.Proiotics组中Escherichia_coli、Odoribacter、Desulfovibrio、Mucispirillum和Anaerotruncus丰度降低，Alloprevotella和Citrobacter丰度增高。PICRUSt功能预测结果显示，相对于FU组，碳水化合物代谢相关基因丰度在FU.ABX组显著升高，而氨基酸、能量代谢和共因子-维生素代谢相关基因丰度明显降低；相较于Control组，FU组中碳水化合物代谢相关基因丰度增高，氨基酸代谢和共因子-维生素代谢相关基因丰度降低。
4.　小肠组织HE染色结果显示，FU组和FU.ABX组小肠粘膜结构不完整，FU.Probiotics组与对照组小肠粘膜结构完整。ELISA结果显示，相对于FU组，FU.ABX组TNF-α和IFN-γ显著降低，IL-10水平明显增高；FU.Probiotics组TNF-α水平显著升高。RT-qPCR结果显示，与Control组比较，FU组BAX和Caspase-3　mRNAs表达量增高，BCL-2　mRNA表达下降，VEGFAmRNA表达下降；相对于FU组，FU.ABX组BAX和Caspase-3　mRNAs表达下降，VEGFA　mRNA表达增高；FU.Probiotics组中VEGFA　mRNA表达降低。
结论：
1.　　混合抗生素的应用使FU.ABX组5-FU抗肿瘤效果减弱；益生菌对5-FU抗肿瘤效果无明显改变，但益生菌改善了小鼠的基本情况，可减轻化疗毒副作用。
2.　　5-FU化疗可降低肠道菌群的多样性，改变肠道菌群结构；抗生素进一步破坏肠道菌群结构，使机会致病菌数量急剧增加，有益菌数量减少；补充益生菌可降低有害菌并增加有益菌丰度。
3.　　混合抗生素可能影响肠道菌群氨基酸代谢、能量代谢、碳水化合物代谢和共因子-维生素等代谢相关基因的表达。
4.　　肠道菌群可能参与调节机体细胞因子表达水平，从而影响抗肿瘤微环境；肠道菌群的改变可能与肠外肿瘤细胞增殖、凋亡相关基因的差异表达有关。